Conocimientos previos
Descripción
Este método consiste en separar el ARN mensajero (ARNm) de una muestra de ARN total. Para llevar a cabo este método se debe unir una secuencia corta de repetidos de timinas, llamada oligo-dT, a un extremo del ARNm . Luego, usando una enzima (llamada transcriptasa reversa o RT) se genera una cadena de ADN llamado complementario (ADNc). Esta cadena de ADNc es posteriormente usada en otras técnicas de biología molecular y/o biotecnológicas. En la investigación biomédica esta técnica puede usarse para estudiar la expresión génica en una enfermedad, ya sea de manera específica (un gene o algunos genes) o de manera total, llamada transcriptoma1.
Material
- ARN total: Este se obtiene a partir de la extracción de una muestra biológica (ver Método extracción de ARN total).
- Oligo-dT: secuencia de nucleótidos 18 repetidos de timina en promedio 5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3´
- Transcriptasa reversa (ezima RT): Enzima que tiene como función sintetizar ADNc de una cadena utilizando como molde ARNm, en una reacción acuosa.
- dNTPs: son nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de ADN.
- Iones: en la reacción de la RT son elementos necesarios para el buen funcionamiento de la enzima; generalmente se usa el ion de magnesio como cloruro de magnesio MgCl2 el cual se disocia en el agua.
- Termociclador: aparato que eleva y baja la temperatura en tiempos cortos para poder llevar a cabo la reacción de Transcripción reversa.
- RNAsa: enzima que rompe específicamente cadenas de ARN con el fin de evitar contaminación de este material.
- Espectrofotómetro: equipo que sirve para medir la concentración de los ácidos nucleicos.
Procedimiento
- Unión del oligo-dT: El oligo-dT reconoce a los repetidos de Adenina (poliA) que se encuentran en un extremo del ARNm; esto se realiza subiendo la temperatura alrededor de 42 °C.
- Reacción de la transcripción reversa: Se agrega la enzima transcriptasa reversa (RT) y posteriormente se sube la temperatura en un rango de 40-65°C; entonces la enzima comienza a
- transcribir a partir del ARNm y genera una cadena de ADN llamada ADNc.
- Desnaturalización la RT: Usando temperaturas altas (alrededor de 85°C) se inactiva la función de la enzima (RT).
- Degradación del ARN con una RNAsa: en este proceso se rompe específicamente a las cadenas ARN restantes con el fin de evitar contaminación de este material.
- Cuantificación de ADNc: se cuantifica la cantidad de ADNc obtenido mediante un espectrofotómetro.
Resultado
Moléculas de ADNc provenientes del ARNm de una muestra de ARN total.
Fuentes de error más frecuentes
Mala calidad del ARN,
Baja concentración de ARN
Contaminación con ADN
Alta concentración de sales
Errores comunes en las técnicas de biología molecular
Aplicaciones
PCR
qPCR
Microarreglos
Trancriptomas (secuenciación masiva)
Temas relacionados
Extracción de ARN total.
Notas
Estos ADNc son usados generalmente para realizar una PCR, qPCR o para el análisis de transcriptomas.
Cómo citar: Checa Rojas, A. (2016, 22 de Junio ) Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc. Conogasi, Conocimiento para la vida. Fecha de consulta: Octubre 11, 2024
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