Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc

Conocimientos previos

• Extracción de ARN total  ^[1]
• ARN ^[2]
• ARNm ^[3]
• Procesamiento del ARNm  ^[4]
  

Descripción

Este método consiste en separar el ARN mensajero (ARNm) de una muestra de  ARN total. Para llevar a cabo este método se debe unir una secuencia corta de repetidos de timinas, llamada oligo-dT, a un extremo del  ARNm . Luego, usando una enzima (llamada transcriptasa reversa o RT) se genera una cadena de  ADN llamado complementario (ADNc). Esta cadena de ADNc es posteriormente usada en otras técnicas de biología molecular y/o biotecnológicas. En la investigación biomédica esta técnica puede usarse para estudiar la  expresión génica en una enfermedad, ya sea de manera específica (un gene o algunos genes) o de manera total, llamada  transcriptoma1.

 

Material

• ARN total: Este se obtiene a partir de la extracción de una muestra biológica (ver Método extracción de ARN total).
• Oligo-dT: secuencia de nucleótidos 18 repetidos de timina en promedio 5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3´
• Transcriptasa reversa (ezima RT):  Enzima que tiene como función sintetizar ADNc de una cadena utilizando como molde  ARNm, en una reacción acuosa.
• dNTPs: son nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de  ADN.
• Iones: en la reacción de la RT son elementos necesarios para el buen funcionamiento de la enzima; generalmente se usa el ion de magnesio como cloruro de magnesio MgCl₂ el cual se disocia en el agua.
• Termociclador: aparato que eleva y baja la temperatura en tiempos cortos para poder llevar a cabo la reacción de Transcripción reversa.
• RNAsa: enzima que rompe específicamente cadenas de ARN con el fin de evitar contaminación de este material.
• Espectrofotómetro: equipo que sirve para medir la concentración de los ácidos nucleicos.

Procedimiento

1. Unión del oligo-dT: El oligo-dT reconoce a los repetidos de Adenina (poliA) que se encuentran en un extremo del  ARNm; esto se realiza subiendo la temperatura alrededor de 42 °C.
2. Reacción de la transcripción reversa: Se agrega la  enzima  transcriptasa reversa (RT) y posteriormente se sube la temperatura en un rango de 40-65°C; entonces la  enzima  comienza a
3. transcribir a partir del  ARNm  y genera una cadena de  ADN llamada ADNc.
4. Desnaturalización la RT: Usando temperaturas altas (alrededor de 85°C) se inactiva la función de la enzima (RT).
5. Degradación del ARN con una RNAsa: en este proceso se rompe específicamente a las cadenas ARN restantes con el fin de evitar contaminación de este material.
6. Cuantificación de ADNc: se cuantifica la cantidad de ADNc obtenido mediante un espectrofotómetro.
   

Resultado

Moléculas de ADNc provenientes del  ARNm de una muestra de  ARN total.

 

Fuentes de error más frecuentes

Mala calidad del ARN,

Baja concentración de ARN

Contaminación con ADN

Alta concentración de sales

Errores comunes en las técnicas de biología molecular

 

Aplicaciones

PCR

qPCR

Microarreglos

Trancriptomas (secuenciación masiva)

Temas relacionados

Extracción de ARN total. 

Notas

Estos ADNc son usados generalmente para realizar una PCR, qPCR o para el análisis de transcriptomas.