Método: Gel de electroforesis Agarosa

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Introducción

La electroforesis es un método de separación de biomoléculas de acuerdo a su tamaño, permitiendo además su aislamiento cortando la zona de interes. La electroforesis en ácidos nucleicos es muy versatil, porque permite una observación directa de cada fragmentos separado directamente en el gel, ya que, su tinción mediante un compuesto llamado bromuro de etidio, hace visible al ADN o ARN (fluoresce) mediante la emición de luz ultravioleta. Los geles de poliacrilamida y agarosa son utilizados para la separación de fragmentos de ácidos nucleicos cuando una corriente eléctrica se aplica sobre el gel. El ADN tiene una carga negativa a pH7, y migra hacia el ánodo (polo positivo). La poliacrilamida es más efectiva que los geles de agarosa cuando se desean separar fragmentos pequeños de ADN entre 5 a 500 pares de bases (bp). Estos geles incluso pueden separar fragmentos que difieren en sólo una base, pero estos son más complicados de hacer y se corren en camaras especiales y debido a los bajos costos de secuenciación han quedado obsoletos. Por otra parte, los geles de agarosa se utilizan comúnmente para separar fragmentos desde 200 bp hasta más de 1 Mb que es igual a 10,000 Kb o un millón de bp. Estos geles se usan generalmente en posición horizontal y con una corriente eléctrica constante. Los fragmentos más grandes de ADN, de hasta 10 Mb aprox. pueden separarse por la técnica de electroforesis de campos pulsados (para más detalles ver: “pulsed-field gel electrophoresis”), en donde la dirección del flujo de la corriente eléctrica cambia constantemente.

La agarosa es un polímero lineal de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. El gel se obtiene disolviéndo la agarosa en un buffer de TAE o TBE y se funde usando un microondas, hasta obtener una solución homogénea y transparente. La disolución se vacía en un molde y se coloca un peine (el peine forma unos pozos donde se depositan las muestras). Se deja enfriar para polimerizar para formar una matriz porosa variando el tamaño del poro según la concentración de agarosa contenida en la disolución. Además, la migración de los fragmentos de ADN varirán dependiendo del tamaño, conformación molecular (lineal, circular, superenrollado), concentración de la agarosa en el gel, voltaje, dirección del campo eléctrico, presencia de colorantes añadidos que se intercalan en el ADN (como el bromuro de etidio y SYBR-green) y de la composición del buffer en el gel.

Cuando el ADN se deposita en los pozos del gel debe mezclarse con un buffer de carga (Tabla loading buffer) este permite:

1) aumentar la densidad de la muestra para depositarse en el fondo del pozo

2) teñir la muestra para facilitar su carga dentro del gel

3) identificar la distancia recorrida por las muestras:

Migrción del colorante en  0.5–1.4% Agarosa.

Los colorantes migrarán al mismo punto que el ADN de doble cadena indicado el tamaño en el gel de agarosa. NOTA: Los tamaños son aproximados.

Colorante Tamaño aprox.
GoTaq® blue dye 4 kb
Xylene cyanol FF 4 kb
Bromophenol Blue 300 bp
Orange G 50 bp
GoTaq® yellow dye 10 bp

Porcentaje de Gel: Resolución de ADN lineal en geles de agarosa.

Recomendado

%

Resolución óptima para ADN lineal (bp)
0.5 1,000–30,000
0.7 800–12,000
1.0 500–10,000
1.2 400–7,000
1.5 200–3,000
2.0 50–2,000

Procedimiento

  1. Para preparar un gel de agarosa al 1% se debe pesar 1g de agarosa y se disuelve en 100 mL de TAE, TBE 1X.
  2. Se adiciona la agarosa en los 100 mL del buffer de nuestra elección (ver tabla de Comparación de buffers).
  3. Se calienta la mezcla contenida en un matraz ex profeso, en un horno de microondas dando pulsos de 30 segundos hasta lograr fundir la agarosa. NOTA: evite la ebullición violeta de la mezcla. 
  4. Se coloca la bandeja en gel caster y gire la palanca de levas y cerciórese de que cierra hermeticamente. NOTA: se debe nivelar el “gel caster” antes de colocar la bandeja 
  5. Se vacia la mezcla agarosa/buffer caliente evitando burbujas y se coloque un peine. NOTA: no agregar muy caliente la disolución para conservar la bandeja en buen estado.
  6. Se deja enfriar hasta que polimerize solidifique el gel.
  7. Se colocan las muestras de ADN en cada pozo
  8. Se corre el gel entre 70 – 100 V por una hora o una hora y media. NOTA: el tiempo y el voltaje requerirán de una estandarización 
  9. Se retira el gel y se deja tiñendo 30 min. en una disolución del buffer seleccionado con bromuro de etidio (EtBr) o con SYBR-green. El EtBr se agrega a una concentración entre 200-500 ng/mL en el gel de agarosa; el SYBR-green se usa según las caracteristicas de cada proveedor. NOTA: El EtBr es mutagénico y se debe manejar con mucho cuidado, el SYBR-green es 25 veces más sensible que el EtBr usando un transiluminador estandar a 300nm. 
Procedimiento y materiales para un gel de agarosa (ADN).

TAE 50X

Tris Base 2M 242.0g
Ac. Acético Glacial 57.1mL
EDTA 0.5 M, pH 8.0 100mL
Aforar con H2O ultra pura 1000mL

TBE 50X 

Tris Base 2M 242.0g
Ác. Borico 55 g
EDTA 0.5 M, pH 8.0 400mL
Aforar con H2O ultra pura 1000mL

 

Tabla loading buffer (6X). NOTA: almacenar a 4°C

 

glicerol 30% (v/v)
Azul de bromofenol 0.25% (p/v)
Xileno Cianol FF 0.25% (p/v)

 

Tabla Comparación entre los buffers TBE vs TAE

Caracteristicas del Buffer TBE TAE Observaciones 
Capacidad de Buffering Alto Bajo TAE deja de funcionar adecuadamete en tiempos prolongados de electroforesis o en varias repeticiones
Migración del ADN bicatenario Lento Rápido TAE tiene mejor conductividad
Resolución Alta resolución en fragmentos largos Alta resolución  fragmentos cortos TBE soporta mejor la reticulación de la agarosa que el TAE
Modificación enzimatica Baja Alta El Borato del TBE es un inhibidor de muchas enzimas
Recuperación de ADN del gel de agarosa Baja Alta El Borato del TBE interactua con el ADN
Integridad del ADN Alta Baja El Borato del TBE inhibe la actividad enzimatica incluyendo las enzimas que modifican el ADN
Concentración de trabajo 1X 0.5X Menor concentración del TAE durante la electroforesis
Costo Costoso Barato

Referencias:

Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. CSH . (2007). DNA loading buffer (6X). 2017, de Cold Spring Harbord Protocols Sitio web: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/6/pdb.rec11045.full?text_only=true scilifelab.com (2017). Comparison of TAE and TBE electrophoresis buffer. 2017 , de scilifelab.com Sitio web: http://www.scilifelab.com/techniques/comparison-tae-tbe-electrophoresis-buffer/

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2 Comentarios en "Método: Gel de electroforesis Agarosa"

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Hola Alberto, Antes que nada felicidades por tu participación en el proyecto. Tu contribución me parece muy interesante e incluso clara. Aquí te dejo algunas de las observaciones que detecte para una mejora en tu contribución: 1. Poner acento en la palabra biomoléculas (en este texto se explica que sí debe llevar acento https://llevatilde.es/palabra/biomoléculas). 2. Esperaria ver la descripción de la palabra "tinción". 3. Considero que las palabras ADN y ARN deberían tener link al diccionario (solo en el primer párrafo que se mencionan para no repetirlos en el resto de la contribución). 4. Me dió confusión estos textos: Se… Leer más »
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