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Método: Gel de electroforesis Agarosa

Autor: Alberto Checa Rojas

Descripción

La electroforesis es un método de separación de biomoléculas como el ADN [1]o ARN [2]de acuerdo a su tamaño, permitiendo además su aislamiento cortando la zona de interés. La electroforesis en ácidos nucleicos es muy versátil, porque permite una observación directa de cada fragmentos separado directamente en el gel, ya que, su tinción [3] mediante un compuesto llamado bromuro de etidio, hace visible al ADN o ARN (fluoresce) mediante la emisión de luz ultravioleta. Cuando una corriente eléctrica se aplica sobre el gel de agarosa el ADN tiene una carga negativa y migra hacia el ánodo (polo positivo).

La agarosa es un polímero lineal de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. El gel se obtiene disolviendo la agarosa en un buffer de TAE o TBE y se funde usando un microondas, hasta obtener una solución homogénea y transparente. La disolución se vacía en un molde y se coloca un peine (el peine forma unos pozos donde se depositan las muestras). Se deja enfriar para polimerizar para formar una matriz porosa variando el tamaño del poro según la concentración de agarosa contenida en la disolución. Además, la migración de los fragmentos de ADN variarán dependiendo del tamaño, conformación molecular (lineal, circular, superenrollado), concentración de la agarosa en el gel, voltaje, dirección del campo eléctrico, presencia de colorantes añadidos que se intercalan en el ADN (como el bromuro de etidio y SYBR-green) y de la composición del buffer en el gel.

Cuando el ADN se deposita en los pozos del gel debe mezclarse con un buffer de carga (Tabla loading buffer) este permite:

1) aumentar la densidad de la muestra para depositarse en el fondo del pozo

2) teñir la muestra para facilitar su carga dentro del gel

3) identificar la distancia recorrida por las muestras:

 

La migración del colorante contenido en el buffer de carga en un gel con 0.5–1.4% Agarosa.

Los colorantes migrarán partiendo del mismo punto que el ADN y ayudan a indicar la posición de corrimiento del ADN en el gel de agarosa.

NOTA: Los tamaños son aproximados.

Colorante Tamaño aprox.
GoTaq® azul 4 kb
Xileno cianol FF 4 kb
Azul de bromofenol 300 bp
Naranja G 50 bp
GoTaq® amarillo 10 bp

Porcentaje de Gel: Resolución de ADN lineal en geles de agarosa.

Recomendado % Resolución óptima para ADN lineal (bp)
0.5 1,000–30,000
0.7 800–12,000
1.0 500–10,000
1.2 400–7,000
1.5 200–3,000
2.0 50–2,000

Materiales

Reactivos

Procedimiento

  1. Para preparar un gel de agarosa al 1% se debe pesar 1g de agarosa y este se disuelve en 100 mL de buffer TAE 1X o TBE 1X (ver tabla de Comparación de buffers).
  2. Caliente la mezcla contenida en un matraz ex profeso, en un horno de microondas dando pulsos de 30 segundos hasta lograr una mezcla homogénea. NOTA: evite la ebullición violenta de la mezcla. 
  3. Coloque la bandeja en el caster gel y gire la palanca de levas. Cerciórese de que cierra herméticamente. NOTA: se debe nivelar el “gel caster” antes de colocar la bandeja 
  4. Si no tiene un caster gel puede utilizar cinta adhesiva en ambos extremos de la bandeja
  5. Vacíe con mucho cuidado la mezcla caliente de agarosa/buffer caliente evitando hacer burbujas y coloque un peine en un extremo. NOTA: no agregar muy caliente la mezcla sobre la bandeja
  6. Se deja enfriar hasta que polimeriza el gel
  7. Se colocan de 2-20 µg/µL de  muestras de ADN en cada pozo con buffer de carga (ver tabla 1)
  8. Se corre el gel a 70 volts por una hora o una hora y media. NOTA: el tiempo y el voltaje requerirán de una estandarización 
  9. Se retira el gel y se deja tiñendo 30 min. en la disolución del buffer que anteriormente se ha seleccionado y se agrega bromuro de etidio (EtBr). El EtBr se agrega a una concentración entre 200-500 ng/mL en el gel de agarosa. NOTA: El EtBr es mutagénico [4] y  por lo tanto se debe manejar con mucho cuidado. Se puede utilizar SYBR-green desde que se carga la muestra y es 25 veces más sensible que el EtBr usando un transiluminador estándar a 300 nm. 
Procedimiento y materiales para la polimerización de un gel de agarosa. 1. Se coloca la bandeja en el caster gel. 2. Se caliente el buffer TAE o TBE con agarosa y se calienta, cuando está disuelta la agarosa se deja enfriar un poco y se coloca en la bandeja. 3. Se deja enfriar para polimerizar el gel. 4. Cuando el gel ha polimerizado se coloca dentro de la cámara de electroforesis horizontal. 5. Se coloca el buffer de corrida, se carga el ADN, se tapa y conecta a una fuente de poder entre 70-100 V/h.

TAE 50X

Tris Base 2M 242.0g
Ac. Acético Glacial 57.1mL
EDTA 0.5 M, pH 8.0 100mL
Aforar con H2O ultra pura 1000mL

TBE 50X 

Tris Base 2M 242.0g
Ác. Bórico 55 g
EDTA 0.5 M, pH 8.0 400mL
Aforar con H2O ultra pura 1000mL

 

Tabla 1. buffer de carga (6X). NOTA: almacenar a 4°C

glicerol 30% (v/v)
Azul de bromofenol 0.25% (p/v)
Xileno Cianol FF 0.25% (p/v)

 

Tabla 2. Comparación entre los buffers TBE vs TAE

Características del Buffer TBE TAE Observaciones 
Capacidad de Buffering Alto Bajo TAE deja de funcionar adecuadamente en tiempos prolongados de electroforesis o en varias repeticiones
Migración del ADN bicatenario Lento Rápido TAE tiene mejor conductividad
Resolución Alta resolución en fragmentos largos Alta resolución  fragmentos cortos TBE soporta mejor la reticulación de la agarosa que el TAE
Modificación enzimática Si No El Borato del TBE es un inhibidor de muchas enzimas
Recuperación de ADN del gel de agarosa Baja Alta El Borato del TBE interactúa con el ADN
Integridad del ADN Alta Baja El Borato del TBE inhibe la actividad enzimática incluyendo las enzimas que modifican el ADN
Concentración de trabajo 1X 0.5X Menor concentración del TAE durante la electroforesis
Costo Costoso Barato