Método: Western blot (transferencia semi-seca)

Introducción

La transferencia de proteínas o western blot es una técnica muy usada en áreas de biología celular, bioquímica y biología molecular. La técnica usa tres pasos para llevarla a cabo:

1. La separación de proteínas por peso molecular en geles de poliacrilamida
2. La transferencia a una membrana o soporte sólido, que permite su manipulación
3. El marcaje de la proteína blanco utilizando un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario acoplado a una molécula que permite su visualización. NOTA: puede haber anticuerpos primarios ya acoplados con moléculas que permiten la visualización de la proteína blanco. 

Materiales

1. Gel con proteínas cargadas y separadas previamente (ver abajo)
2. Camara de transferencia semiseca para Western blot
3. Papeles whatman No1 o 2 del tamaño del gel. NOTA: 6 papeles whatman por cada gel
4. Recipientes del tamaño del gel. NOTA: ahí se colocará el buffer de corrida, el metanol y se pondran a incubar con los anticuerpos. Se puede usar tubos de 50 mL
5. Membrana de PVDF o nitrocelulosa
6. Bisturi o tijera
7. Fuente de poder

Reactivos

1. Tris Base
2. Glicina
3. NaCl
4. HCl
5. Tween 20
6. Albumina Bovina/leche descremada tipo Svelty
7. Ácido acético
8. Acetato de sodio
9. Anticuerpos primarios y secundarios
10. N,N-Dimetilformamida ≥98%
11. 3-Amino-9-etilcarbazol
12. H₂O₂

Procedimiento

Carga y corrida del gel

1. En el primer carril cargue el marcador de peso molecular. NOTA: se usan preferentemente marcadores preteñidos
2. Cargue concentraciones entre 20-30 μg de proteína total o de 10-100 ng de proteína purificada y llévelos a volúmenes iguales y colóquelos en los pozos del gel SDS-PAGE.
3. Corra el gel durante 40 min – 1 hora a 150 V o 35mA. NOTA: El tiempo y corriente eléctrica pueden requerir optimización.

Porcentaje de acrilamida en el gel/tamaño de la proteína de interés

NOTA: Los geles de gradiente también pueden ser utilizados.

Transferencia semi-seca de las proteínas del gel a la membrana

NOTA: Para este procedimiento se pueden utilizar membranas de nitrocelulosa o PVDF.

1. Después de correr el gel de poliacrilamida se deja el gel en buffer WBTB 1X
2. Se equilibran las membranas de PVDF colocandolas en metanol durante 1 minuto y posteriormente se lavan con buffer WBTB 1X; si es de nitrocelulosa se coloca en el buffer WBTB 1X.
3. Se colocan 3 papeles whatman del tamaño de la membrana empapados de buffer WBTB 1X.
4. Posteriormente se coloca la membrana previamente equilibrada y lavada
5. Y enseguida se coloca el gel sobre la membrana y 3 papeles whatman encima del gel. NOTA: se debe cerciorar de no dejar burbujas que bloqueen la transferencia 
6. Se cierra cuidadosamente la cámara y se conecta a la fuente de poder. NOTA: El tiempo y el voltaje de la transferencia pueden requerir cierta optimización.
7. La transferencia de proteínas de la membrana se puede verificar usando la tinción con Rojo Ponceau S antes del paso de bloqueo o marcadores preteñidos. NOTA: se pude checar cuidadosamente la transferencia separando el gel de los marcadores esto ayuda a observar si la transferencia es completa. 
8. Terminando la transferencia se bloquea con Albumina bovina sérica (BSA) al 5%  o con leche descremada al 5% en TBST 1X por 10min en agitación.
9. Se hacen 3 lavados con TBST 1X y se preparan los anticuerpos según las recomendaciones del fabricante en TBST (1:10,000, 1:5000, etc.). NOTA: todos los anticuerpos requieren una estandarización previa.  
10. Se puede dejar toda la noche en agitación a 4°C o a temperatura ambiente 2 horas.
11.  Se retira el anticuerpo y se realizan 3 lavados con TBST por 2 min
12. Se prepara y coloca el anticuerpo secundario con las características del fabricante y se deja en agitación a temperatura ambiente 2 horas
13. Se retira el anticuerpo y se realizan 3 lavados con TBST por 2 min
14. Dependiendo de la molécula con la que este acoplado el anticuerpo secundario será el procedimiento a seguir.
15. Si los anticuerpos están acoplados a HRP se pueden realizar una reacción colorimétrica con Carbazol.
16. Agregue en un tubo de 15mL, 2.25 mL de la disolución Stock de Carbazol (ver tabla), y posteriormente agregue 6 mL de buffer de Acetatos (ver tabla abajo) y 15 µL de H₂O₂
17. Coloque la membrana en un recipiente y posteriormente la mezcla de Carbazol y espere a que las bandas se tiñan de un color Rojo carmesí (ver fotografía abajo).

Para prepara el sándwich de para la corrida de western blot debe ser de la siguiente manera:

Western Blot Transfer Buffer: WBTB 10X

NOTA: al preparar la disolución al 1X se debe agregar 20% de metanol, para 1L:
Se agregan 100 mL del WBTB 10X, se agregan agua ultra pura o bidestilada 400 mL , se añaden los 200 mL de metanol y se afora a 1L. 

TBST 10X

NOTA: colocar Tween al 0.1% al preparar la disolución 1X

Stock de Carbazol para 100mL

Buffer de Acetatos pH 5.2

Ejemplo de una tinción con Carbazol: