Método: Gel de poliacrilamida de dos dimensiones 2D-PAGE

Descripción

La electroforesis de proteínas de dos dimensiones es una técnica que ha precedido el nacimiento de la proteómica. Y si bien, no es el único esquema utilizado en la proteómica actual, aún es utilizada por sus características y diversas ventajas. Al comienzo de los años 70, la separación proteica de alto rendimiento se realizaba mediante técnicas electroforéticas en presencia de SDS, descrita por Laemmli (Laemmli UK, 1970), una técnica que continúa siendo muy popular, y por otra parte, se realizaba también la separación proteica mediante el isoelectroenfoque, descrito por Gronow y Griffith. No tardó mucho para que estas dos técnicas se unieran, ya que, separaban de manera independiente la masa y el punto isoeléctrico de las proteínas. El primer informe sobre una separación de dos dimensiones (2D) fue en 1974 llevada a cabo por MacGillivray y Rickwood, pero no sorprendieron a la comunidad científica debido a su complejidad y su poca resolución en el gel. No fue sino hasta el siguiente año que O’Farrell mejoró la técnica y mostrando un patrón electroforético mucho mayor debido a que marcó a las proteínas con un isótopo radioactivo de azufre (³⁵S) aumentando la resolución.

Este reporte logró que fuera más fácil la reproducibilidad y la ejecución de la técnica y en consecuencia, permitió la comparación de varios geles en paralelo aumentando la reproducibilidad de las muestras y su comparación. Está técnica es aún usada en nuestros días y poco ha cambiado desde entonces, y aunque el nombre de electroforesis 2D puede sugerir un proceso de dos pasos, en realidad es un proceso de varios pasos y puede durar varios días en su preparación hasta la tinción y se pueden enlistar de manera general de la siguiente manera:

1. Extracción de proteínas y preparación de la muestra
2. Primera separación por punto isoeléctrico (1D)
3. Segunda separación por peso molecular (2D)
4. Tinción de los geles (4 días hasta este punto)
5. Comparación de cada gel mediante un análisis de imagen
6. Finalmente la identificación de las proteínas (western blot, MALDI, LC-MS/MS).

Materiales

1. micropipetas
2. puntas de 1 mL
3. puntas de 20-200 µL
4. guantes de nitrilo o latex
5. tubos de 15 mL
6. tubos de 50 mL
7. tubos de 1.5 mL
8. gradillas para tubos
9. gradilla para geles grandes
10. criocajas
11. jeringas de 10 mL
12. jeringa Hamilton 20 µL
13. vaso de precipitados
14. parafilm
15. pegamento adhesivo de barra
16. recipientes de plástico
17. matraces de 250 mL
18. probetas de diversos volumenes (100 mL – 2 L)
19. vortex
20. centrifuga
21. potenciómetro
22. fuente de poder (rango 5000 V y una corriente de 110 mA)
23. cámara de 1D
24. tubo de vidrio
25. embudo de acrilico para geles 1D
26. cámara de 2D
27. enfriador peltier para cámara de 2D
28. cristales para 2D
29. cassette para geles de 2D
30. Soporte universal
31. aro para recipientes
32. nuez para soporte universal
33. manguera de silicona
34. broches para manguera
35. acetatos
36. neoprenos del tamaño de los cristales de 2D

Reactivos

1. Agarosa
2. Acrilaimda
3. Bis-acrilamida
4. Persulfato de amonio
5. TEMED
6. Tris base
7. Tris HCl
8. Glicina
9. SDS
10. Sacarosa
11. Polivinilpolipirrolidona (PVPP)
12. Urea
13. Tiourea
14. Tributilfosfato (TBP)
15. CHAPS
16. Ditiotreitol (DDT)
17. Brillant blue G230
18. Isopropanol
19. Metanol
20. Fenol
21. Acetato de amonio
22. Coomassie
23. Anfolitas
24. NP-40

Procedimiento

Geles de 1D

1. Proceda hacer la extracción proteica como está descrito en el método: gel de acrilamida
2. Teniendo las muestras extraídas se almacenan a -80°C hasta su uso
3. Prepare alícuotas de acrilamida para los geles de 1D (ver tabla 1)
4. Corte los tubos capilares a 23.5 cm de largo (luz 3mm y 1mm de grosor)
5. Se coloca en el recipiente del embudo para preparar los geles de 1D con 6 mL de la alícuota de 1D
6. Se agregan anfolitas según sean las necesidades del experimento (ejemplo: 108.4 µL anfolitas 3-10 pH, suplementada con 162.1 µL anfolitas 6-8 pH) NOTA: suplementar con otro rango más estrecho de pH enriquece la ventana de entidades electroforéticas, permitiendo mejorar la visualización de las manchas del gel. 
7. Se agrega a la alícuota 42.5 µL de Persulfato de amonio al 10% y 21 µL de TEMED
8. Teniendo la alícuota preparada con las anfolitas y el TEMED se colocan los capilares dentro del embudo para después colocar armar el embudo y el vial (figura 1)
9. Se sumerge con mucho cuidado dentro del contenedor para 1D, para que el agua entre por los orificios del embudo y suba por capilaridad la acrilamida en el tubo de vidrio
10. Se deja polimerizar 1 hora la acrilamida
11. Habiendo polimerizado el gel se procede a colocar cada capilar en la cámara de 1D agregando un empaque en la parte superior
12. Se coloca en la parte inferior de la cámara el buffer ácido agregando 1.4 mL de ácido fosfórico al 85% en 2L de agua ultra pura
13. Se colocan los capilares junto con la parte interna de la cámara y se agrega el buffer básico agregando 10 mL de NaOH  10N y 990 mL de agua ultra pura. NOTA: tener cuidado de no mezclar o salpicar por ningun motivo ambos buffer o de que no haya fugas, ya que esto ocasionara que no se de un enfoque de proteínas efectivo. 
14. Teniendo ambos buffers colocados retire las burbujas de aire dentro de los capilares agregando el buffer básico con una jeriga hamilton
15. Coloque posteriormente de 30-50 µL de buffer de solubilización en una dilución 2:1. NOTA: el buffer puede estar teñido con azul de bromofenol para mejorar su visualización. Este paso es importante ya que se evita el contacto de la muestra proteica con el NaOH
16. Cierre la cámara y conecte a la fuente de poder y proceda a realizar un pre-enfoque a 1000 V por 45 min.
17. Después quite la tapa y cargue con una jeringa hamilton 500 µg de proteína extraidas y solubilizadas como esta descrito en método: gel de acrilamida
18. Cargada la muestra cierre la cámara y conectela a la fuente de poder a 1000 V/h durante 23.5 horas. NOTA: coloque alguna marca en el tubo para no perder el orden de las muestras.
19. Antes de terminar la corrida usted debe preparar los geles para 2D con 2 horas de anticipación (ver abajo). NOTA: si usted carece de experiencia en geles 2D tome sus precauciones y aumente el tiempo 
20. Terminada la corrida de los geles de 1D  retire el buffer básico de los capilares y coloque los capilares sobre hielo
21. Utilice una jeringa y un expulsor de geles como se muestra en la figura 2
22. Retirado el gel, se coloca en un contenedor con buffer de equilibrio (ver tabla 2) y se deja incubando por 5 min cambie el buffer dos veces y deje otros 5 min. NOTA: existen métodos rápidos para visualizar las bandas de la 1D sin afectar la 2D.

Tabla 1. Alícuotas de 1D

NOTA: las alícuotas se filtran con una membrana de 0.45 µm. La urea se debe disolver en baño maría a 37°C evitando que suba la temperatura 

Tabla 2. Buffer de equilibrio

NOTA: Se prepara la disolución A y se almacena. La disolución B se prepara hasta que se va utilizar agregando

el DTT y el azul de bromofenol en 100 mL de disol. A. 

Geles 2D

NOTA: Antes de que finalice la 1D usted debe preparar sus geles para la segunda dimensión 

1. Antes de armar su caster gel verifique que todo su material esta previamente lavado y seco. NOTA: use mezcla crómica para lavar el material de vidrio
2. Arme el caster gel de 2D como se indica en la figura 3
3. Prepare el soporte universal con el vaso que contendrá la acrilamida para los geles de 2D
4. Prepare la disolución de acrilamida para los geles en un vaso de precipitados y sobre un agitador magnético (Tabla 3). NOTA: puede utilizar un clip en lugar de un magneto de mosca. 
5. Teniendo la mezcla de los geles se coloca en el recipiente unido al caster gel evitando en todo momento hacer burbujas. NOTA: Generalmente se preparan los geles al 12%
6. Abra las pinzas de presión con mucho cuidado para que la acrilamida entre al caster y evitando la formación de burbujas. NOTA: si usted observa burbujas puede dar unos golpes sutiles al caster
7. La acrilamida debe llegar hasta el borde de los vidrios evitando derrames
8. Posteriormente agrega isopropanol al 50% y espere aprox. 1h o hasta alcanzar totalmente la polimerización observando el remanente en el vaso unido al caster gel. NOTA: varios factores como la temperatura y el oxígeno pueden afectar la polimerización, tome sus precauciones. 
9. Habiendo terminada la polimerización desarme con mucho cuidado el caster gel
10. Lave con agua corriente los vidrios quitando los remanentes de la polimerización
11. Coloque los vidrios previamente lavados en una gradilla
12. Coloque las tripas de los geles de 1D y adhiéralas con agarosa al 1% y Tris-Gly-SDS 1X. NOTA: agregue azul de bromofenol en la agarosa para visualizar el frente de corrida. 
13. Coloque los vidrios en la cámara de 2D.
14. Llene el tanque de la cámara con Tris-Gly-SDS 1X en la parte de abajo y coloque los empaques si su cámara los lleva.
15. Llene hasta donde indique su cámara en la parte superior con Tris-Gly-SDS 2X.
16. Cierre la cámara y programe su fuente de poder a 1000V/h durante 24 horas. NOTA: usted puede aumentar el voltaje y correr sus geles en menos tiempo pero esto requiere de optimización.

Tabla 3. Geles de 2D

Resultado