Método: Western blot (transferencia semi-seca)

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Introducción La transferencia de proteínas o western blot es una técnica muy usada en áreas de biología celular, bioquímica y…

Introducción

La transferencia de proteínas o western blot es una técnica muy usada en áreas de biología celular, bioquímica y biología molecular. La técnica usa tres pasos para llevarla a cabo:

  1. La separación de proteínas por peso molecular en geles de poliacrilamida
  2. La transferencia a una membrana o soporte sólido, que permite su manipulación
  3. El marcaje de la proteína blanco utilizando un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario acoplado a una molécula que permite su visualización. NOTA: puede haber anticuerpos primarios ya acoplados con moléculas que permiten la visualización de la proteína blanco. 

Materiales

  1. Gel con proteínas cargadas y separadas previamente (ver abajo)
  2. Camara de transferencia semiseca para Western blot
  3. Papeles whatman No1 o 2 del tamaño del gel. NOTA: 6 papeles whatman por cada gel
  4. Recipientes del tamaño del gel. NOTA: ahí se colocará el buffer de corrida, el metanol y se pondran a incubar con los anticuerpos. Se puede usar tubos de 50 mL
  5. Membrana de PVDF o nitrocelulosa
  6. Bisturi o tijera
  7. Fuente de poder

Reactivos

  1. Tris Base
  2. Glicina
  3. NaCl
  4. HCl
  5. Tween 20
  6. Albumina Bovina/leche descremada tipo Svelty
  7. Ácido acético
  8. Acetato de sodio
  9. Anticuerpos primarios y secundarios
  10. N,N-Dimetilformamida ≥98%
  11. 3-Amino-9-etilcarbazol
  12. H2O2

Procedimiento

Carga y corrida del gel

  1. En el primer carril cargue el marcador de peso molecular. NOTA: se usan preferentemente marcadores preteñidos
  2. Cargue concentraciones entre 20-30 μg de proteína total o de 10-100 ng de proteína purificada y llévelos a volúmenes iguales y colóquelos en los pozos del gel SDS-PAGE.
  3. Corra el gel durante 40 min – 1 hora a 150 V o 35mA. NOTA: El tiempo y corriente eléctrica pueden requerir optimización.

Porcentaje de acrilamida en el gel/tamaño de la proteína de interés

Tamaño de la Proteína % del Gel
4–40 kDa 20%
12–45 kDa 15%
10–70 kDa 12%
15–100 kDa 10%
25–100 kDa 8%

NOTA: Los geles de gradiente también pueden ser utilizados.

Transferencia semi-seca de las proteínas del gel a la membrana

NOTA: Para este procedimiento se pueden utilizar membranas de nitrocelulosa o PVDF.

  1. Después de correr el gel de poliacrilamida se deja el gel en buffer WBTB 1X
  2. Se equilibran las membranas de PVDF colocandolas en metanol durante 1 minuto y posteriormente se lavan con buffer WBTB 1X; si es de nitrocelulosa se coloca en el buffer WBTB 1X.
  3. Se colocan 3 papeles whatman del tamaño de la membrana empapados de buffer WBTB 1X.
  4. Posteriormente se coloca la membrana previamente equilibrada y lavada
  5. Y enseguida se coloca el gel sobre la membrana y 3 papeles whatman encima del gel. NOTA: se debe cerciorar de no dejar burbujas que bloqueen la transferencia 
  6. Se cierra cuidadosamente la cámara y se conecta a la fuente de poder. NOTA: El tiempo y el voltaje de la transferencia pueden requerir cierta optimización.
  7. La transferencia de proteínas de la membrana se puede verificar usando la tinción con Rojo Ponceau S antes del paso de bloqueo o marcadores preteñidos. NOTA: se pude checar cuidadosamente la transferencia separando el gel de los marcadores esto ayuda a observar si la transferencia es completa. 
  8. Terminando la transferencia se bloquea con Albumina bovina sérica (BSA) al 5%  o con leche descremada al 5% en TBST 1X por 10min en agitación.
  9. Se hacen 3 lavados con TBST 1X y se preparan los anticuerpos según las recomendaciones del fabricante en TBST (1:10,000, 1:5000, etc.). NOTA: todos los anticuerpos requieren una estandarización previa.  
  10. Se puede dejar toda la noche en agitación a 4°C o a temperatura ambiente 2 horas.
  11.  Se retira el anticuerpo y se realizan 3 lavados con TBST por 2 min
  12. Se prepara y coloca el anticuerpo secundario con las características del fabricante y se deja en agitación a temperatura ambiente 2 horas
  13. Se retira el anticuerpo y se realizan 3 lavados con TBST por 2 min
  14. Dependiendo de la molécula con la que este acoplado el anticuerpo secundario será el procedimiento a seguir.
  15. Si los anticuerpos están acoplados a HRP se pueden realizar una reacción colorimétrica con Carbazol.
  16. Agregue en un tubo de 15mL, 2.25 mL de la disolución Stock de Carbazol (ver tabla), y posteriormente agregue 6 mL de buffer de Acetatos (ver tabla abajo) y 15 µL de H2O2
  17. Coloque la membrana en un recipiente y posteriormente la mezcla de Carbazol y espere a que las bandas se tiñan de un color Rojo carmesí (ver fotografía abajo).

 

Para prepara el sándwich de para la corrida de western blot debe ser de la siguiente manera:

 

Procedimiento del Western blot

Western Blot Transfer Buffer: WBTB 10X

Tris base 30,3g
Glicina 144g
Ajustar pH a 8.6
Aforar a 1L

NOTA: al preparar la disolución al 1X se debe agregar 20% de metanol, para 1L: se agregan 100 mL del WBTB 10X, con 200 mL de metanol y se afora con agua ultra pura. 

TBST 10X

Reactivo  para 1L 10X Concentración Final 1X
Tri base 12.11g 10mM
NaCl 80.8g 138mM
Aforar a 1L

NOTA: colocar Tween al 0.1% al preparar la disolución 1X

Stock de Carbazol para 100mL

Carbazol 800mg
N,N-dimetilformamida 100mL

Buffer de Acetatos pH 5.2

Acetato de sodio 13.6 g
dH2O 800 mL
ajustar el pH a 5.2 con ácido acético
Aforar a 1L

Ejemplo de una tinción con Carbazol:

Tinción de carbazol. En esta fotografía se observan 3 muestras de tumores de lineas celulares generados en ratones desnudos atímicos: Nu/Nu, colectados a diferentes tiempos (30, 45 y 50 días). Anticuerpo primario: Anti-actina 40kDa; acoplado a HRP. NOTA: en este tipo de anticuerpos primarios que están acoplados a una molécula, no es necesario agregar un anticuerpo secundario, por lo que despues de su incubación y lavados se procede a teñir la membrana. Fotogradía tomada por: Alberto Checa R.

 

 

 

 

Referencias:

Abcam . (1998-2017). Western blot protocol. Octubre 2017, de Abcam Sitio web: http://www.abcam.com/protocols/general-western-blot-protocol
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Cómo citar: Checa Rojas, A. (2017, 27 de Octubre ) Método: Western blot (transferencia semi-seca). Conogasi, Conocimiento para la vida. Fecha de consulta: Noviembre 16, 2018

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1 Comentario en "Método: Western blot (transferencia semi-seca)"

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Julio Collado Vides

Tengo tres comentarios: Está muy claro, me gustan las imágenes, y con datos precisos para hacer una corrida de gel. Dos: Le faltan acentos, lo cual puede verse trivial, pero sin duda le va a pegar negativamente a conogasi; y tres: va muy rápido al grano. Con unas cuantas frases al inicio, podría el no experto quedarse con la idea clara de: para qué sirve el método, qué se logra? Por eso 3 estrellas resulta hasta elevada mi calificación. Ojalá lo mejores. Saludos

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