Método: Medios de cultivo sólidos agar o agarosa


Descripción Los medios de cultivo son soluciones nutritivas utilizadas en laboratorios para cultivar microorganismos. El crecimiento y la supervivencia de los…

Descripción

Los medios de cultivo son soluciones nutritivas utilizadas en laboratorios para cultivar microorganismos. El crecimiento y la supervivencia de los microorganismos dependen del entorno de crecimiento disponible y favorable. Para un cultivo exitoso, es necesario comprender sus requerimientos nutricionales y luego suministrar los nutrientes esenciales en la forma y proporción adecuadas en un medio de cultivo. La composición general de un medio es la siguiente:

  • H-donantes y aceptores (aproximadamente 1-15 g/L)
  • Fuente C (aproximadamente 1-20 g/L)
  • N-fuente (aproximadamente 0.2-2 g/L)
  • Otros nutrientes inorgánicos, p. Ej. S, P (50 mg/L)
  • Elementos traza (0.1-1 μg/L)
  • Factores de crecimiento (aminoácidos, purinas, pirimidinas, generalmente 50 mg/L, vitaminas generalmente 0.1-1 mg/L)
  • Agente solidificante (ej.: agar 10-20 g/L)
  • Disolvente (generalmente agua destilada)
  • Buffers

Material

  • Cajas petri estériles
  • Asa bacteriológica
  • Autoclave
  • Probeta de 100 mL
  • Matraces estériles
  • Botellas de vidrio
  • Aluminio
  • Cinta testigo
  • Camapana de flujo laminar
  • Papel indicador de pH
  • Incubadora
  • Mechero Bunsen
  • Guantes resistentes al calor
  • Guantes de nitrilo
  • Marcadores indelebles
  • Cinta o etiquetas para marcar
  • Refrigerador 4-8°C

Reactivos

  • Agar-agar
  • Agarosa
  • Agua ultra pura o bidestilada
  • Antibióticos

 

Procedimiento

  1. Prepare su medio de elección (ver abajo)
  2. Esterilice en autoclave sus material (ej. matraz, probeta, medio, etc.) durante 20 minutos a 15 psi (1.05 kg/cm2) en el ciclo de líquido.
  3. Cuando retire el medio de la autoclave, hágalo girar suavemente para distribuir el agar o la agarosa derretida de manera uniforme.  PRECAUCIÓN: El fluido puede puede tener una ebullición violenta cuando se agita
  4. Deje enfriar entre 50 °C – 60°C, antes de suplementar con reactivos termolábiles (ej.: antibióticos, proteínas, etc.). NOTA: suplemente dentro de una campana de cultivo y un mechero 
  5. Mezcle el medio haciéndolo girar para evitar la formación de burbujas de aire.
  6. Antes de colocar el medio/antibiótico etiquete sus placas (por ejemplo: marcador rojo para cajas LB-ampicilina, marcador negro para cajas LB-gentamicina, etc.)
  7. Agregue el medio sobre las cajas ~ 30 mL de medio por cada caja de 90 mm. NOTA: no tape aún sus cajas y ordénalas cerca de su tapa dentro de la campana 
  8. Elimine las burbujas usando el mechero Bunsen, coloque la llama sobre la superficie del medio antes de que el agar o la agarosa se endurezca.
  9. Cierre sus cajas y colóquelas una encima de otra. NOTA: esto evitará condensación.
  10. Cuando el medio se haya endurecido por completo, invierta las cajas y guárdelas a 4 °C hasta que se requieran.
  11. Las cajas deben almacenarse al menos 2 hora antes de ser utilizadas.
  12. Cuando las cajas son muy frescas se producirá condensación a 37 °C. Cuando esta condensación cae sobre la superficie de agar y/o agarosa, permite que aumente las posibilidades de contaminación cruzada. Este problema puede evitarse limpiando la condensación de las tapas de las placas y luego incube durante 2 horas a 37 °C en una posición invertida antes de que se usen.

Medios de cultivo

Bacto agar-medio 15 g/L
Bacto agar-medio (top agar) 7 g/L
Agarose-medio 15 g/L
Agarose-medio (top agarose) 7 g/L

NOTA: Para preparar cultivos de bacteriófago combinando fagos con células hospedadoras susceptibles en superposiciones se debe preparar en top agar. Las preparaciones de top agar  contienen concentraciones más bajas de agar (7 g/L) que las soluciones normales usadas para preparar cajas de cultivo con agar (15 g/L).  La baja concentración de agar permite que la progenie del fago de las células lisadas se difunda a través de los medios e infectar otras células bacterianas vecinas. Cuando estas células también se lisan, se produce una zona de células lisadas en la caja. Debido a que el fago solo puede reproducirse en células en crecimiento activo, el tamaño de la zona lisadas dependerá de qué tan pronto las bacterias en el agar alcancen la fase estacionaria y dejen de reproducirse.  Las placas dejarán de expandirse en este punto. 

Referencias:

CSH. (2006). Media containing agar or agarose. 2018, de Cold Spring Harbor Sitio web: doi:10.1101/pdb.rec8734 Cold Spring Harb Protoc 2006.
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Cómo citar: Checa Rojas, A. (2018, 21 de Febrero ) Método: Medios de cultivo sólidos agar o agarosa. Conogasi, Conocimiento para la vida. Fecha de consulta: Diciembre 12, 2018

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