Descripción

Los medios de cultivo son soluciones nutritivas utilizadas en laboratorios para cultivar microorganismos. El crecimiento y la supervivencia de los microorganismos dependen del entorno de crecimiento disponible y favorable. Para un cultivo exitoso, es necesario comprender sus requerimientos nutricionales y luego suministrar los nutrientes esenciales en la forma y proporción adecuadas en un medio de cultivo. La composición general de un medio es la siguiente:

H-donantes y aceptores (aproximadamente 1-15 g/L)
Fuente C (aproximadamente 1-20 g/L)
N-fuente (aproximadamente 0.2-2 g/L)
Otros nutrientes inorgánicos, p. Ej. S, P (50 mg/L)
Elementos traza (0.1-1 μg/L)
Factores de crecimiento (aminoácidos, purinas, pirimidinas, generalmente 50 mg/L, vitaminas generalmente 0.1-1 mg/L)
Agente solidificante (ej.: agar 10-20 g/L)
Disolvente (generalmente agua destilada)
Buffers

Material

Cajas petri estériles
Asa bacteriológica
Autoclave
Probeta de 100 mL
Matraces estériles
Botellas de vidrio
Aluminio
Cinta testigo
Camapana de flujo laminar
Papel indicador de pH
Incubadora
Mechero Bunsen
Guantes resistentes al calor
Guantes de nitrilo
Marcadores indelebles
Cinta o etiquetas para marcar
Refrigerador 4-8°C

Reactivos

Agar-agar
Agarosa
Agua ultra pura o bidestilada
Antibióticos

Procedimiento

Prepare su medio de elección (ver abajo)
Esterilice en autoclave sus material (ej. matraz, probeta, medio, etc.) durante 20 minutos a 15 psi (1.05 kg/cm²) en el ciclo de líquido.
Cuando retire el medio de la autoclave, hágalo girar suavemente para distribuir el agar o la agarosa derretida de manera uniforme. PRECAUCIÓN: El fluido puede puede tener una ebullición violenta cuando se agita
Deje enfriar entre 50 °C – 60°C, antes de suplementar con reactivos termolábiles (ej.: antibióticos, proteínas, etc.). NOTA: suplemente dentro de una campana de cultivo y un mechero
Mezcle el medio haciéndolo girar para evitar la formación de burbujas de aire.
Antes de colocar el medio/antibiótico etiquete sus placas (por ejemplo: marcador rojo para cajas LB-ampicilina, marcador negro para cajas LB-gentamicina, etc.)
Agregue el medio sobre las cajas ~ 30 mL de medio por cada caja de 90 mm. NOTA: no tape aún sus cajas y ordénalas cerca de su tapa dentro de la campana
Elimine las burbujas usando el mechero Bunsen, coloque la llama sobre la superficie del medio antes de que el agar o la agarosa se endurezca.
Cierre sus cajas y colóquelas una encima de otra. NOTA: esto evitará condensación.
Cuando el medio se haya endurecido por completo, invierta las cajas y guárdelas a 4 °C hasta que se requieran.
Las cajas deben almacenarse al menos 2 hora antes de ser utilizadas.
Cuando las cajas son muy frescas se producirá condensación a 37 °C. Cuando esta condensación cae sobre la superficie de agar y/o agarosa, permite que aumente las posibilidades de contaminación cruzada. Este problema puede evitarse limpiando la condensación de las tapas de las placas y luego incube durante 2 horas a 37 °C en una posición invertida antes de que se usen.

Medios de cultivo

Bacto agar-medio ^[1]	15 g/L
Bacto agar-medio (*top agar*)	7 g/L
Agarose-medio	15 g/L
Agarose-medio (top agarose)	7 g/L

NOTA: Para preparar cultivos de bacteriófago combinando fagos con células hospedadoras susceptibles en superposiciones se debe preparar en top agar. Las preparaciones de top agar contienen concentraciones más bajas de agar (7 g/L) que las soluciones normales usadas para preparar cajas de cultivo con agar (15 g/L). La baja concentración de agar permite que la progenie del fago de las células lisadas se difunda a través de los medios e infectar otras células bacterianas vecinas. Cuando estas células también se lisan, se produce una zona de células lisadas en la caja. Debido a que el fago solo puede reproducirse en células en crecimiento activo, el tamaño de la zona lisadas dependerá de qué tan pronto las bacterias en el agar alcancen la fase estacionaria y dejen de reproducirse. Las placas dejarán de expandirse en este punto.