Extracción de ARN total

Conocimientos previos

Célula
ARN
Expresión génica
Transcripción del ADN

Descripción

Es un método por el cual se separa el ARN de otros componentes celulares. En la investigación biomédica suele utilizarse este método como un paso previo para estudiar otros tipos de ARN, como los ARNm mensajeros (ver Método aislamiento del ARNm) en una enfermedad o en alguna condición de interés.

Muestra

Material biológico:  células , tejido, fluídos corporales, etc.

Proteasas: sirven para romper las proteínas que se unen al ARN.
Solventes orgánicos: soluciones líquidas que permiten mezclar otras sustancias líquidas o sólidas e incorporarlas en una sola, o que facilitan la separación de diversos materiales.
DNAsa I: proteína que rompe el ADN.
Centrífuga: equipo que ayuda a separar componentes mediante la rotación de una muestra.
Espectrofotómetro: equipo que sirve para medir la cantidad de ARN en una muestra.

Procedimiento

1. Obtención del material biológico: se obtienen células de cepillados, tomas de muestras de sangre o tejidos (biopsias).
2. Lisis celular: Se rompen las  células  para liberar sus contenidos (incluyendo al  ADN  junto con el ARN).
3. Degradación de proteínas: Se rompen las proteínas que están unidas al ARN, esto con el fin de poder separarlas del ARN.
4. Proceso de Separación: Se separan los diferentes componentes celulares y se obtiene el ARN mediante precipitación y centrifugación.
5. Solubilización del ARN: se agrega una pequeña cantidad de agua ultra pura al ARN.
6. Degradación de ADN por DNAsa I: Se rompen las cadenas de ADN residual con el fin de evitar contaminación de este material.
7. Cuantificación de ARN: Se mide la cantidad de ARN mediante un  espectrofotómetro a 260/280 nm.

Resultado

Fragmentos de ARN total, consituidos principalmente por: ARN ribosomal, ARN transferencia, ARN mensajero , ARN pequeños o microARNs, provenientes de nuestro material biológico.

Fuentes de error más frecuentes

• Poco material biológico
• Alta concentración de RNAsas presentes en la muestra
• Mala calidad del ARN total
• Errores comunes en las técnicas de biología molecular

Aplicaciones

Aislamiento de ARNm

Aislamiento de microRNAs

Expresión génica

PCR en tiempo real

Transcriptoma por Microarreglos

Transcriptoma secuenciación masiva

Secuenciación  de exones (Exoma)

Esplaiceosoma

Temas relacionados

Extracción de ADN 

Electroforésis

Espectrofotometría

Notas

Todos los materiales que se usan para este método deberán estar químicamente limpios y estériles.

Para hacer alguna de las aplicaciones es necesario revisar la calidad del ARN realizando un gel de electroforesis.

Se observarán 3 bandas abundantes y un barrido (bandas: ARN ribosomales 25S, 18S, 5S y un barrido que son ARN mensajeros de diversos tamaños).

Cambiando el tipo de gel se pueden llegar a observar otras bandas más pequeñas como ARN pequeños y microARNs.