Método: ligamiento con T4 ADN ligasa

La reacción con la enzima ligasa cataliza la unión de dos moléculas deseadas de ADN (inserto y vector) en un plásmido generalmente a partir de la formación de enlaces covalentes. Los plásmido son vectores de clonación útiles porque son fáciles de duplicarse en un alto número de copias en las células bacterianas, además de que son faciles de aislar y purificar. Los plásmidos más comúnmente utilizados en la tecnología del ADN recombinante se replican en E. coli. En general, estos plásmidos se han diseñado para optimizar su uso como vectores en la clonación de ADN. Para seleccionar un vector de clonación se deben conciderar las siguientes características:

1. El ADN inserto debe tener dos sitios de corte en los extremos donde se ligara al plásmido (ej. sitios Hind III, BamHI, etc.). NOTA: estos sitios pueden ser agregados en los primers de una PCR 
2. El vector debe poseer sitios únicos de corte para las enzimas de corte de nuestro inserto
3. El plásmido debe ser de tamaño pequeño
4. El vector debe tener una replicación independiente.
5. Debe tener algún marcador de selección (ej.: antibiótico)

Una vez seleccionado el vector, éste es cortado con las enzimas de restricción y mezclado al igual que nuestro ADN deseado (inserto). La unión de ambas moléculas involucra la formación de un enlace fosfodiester entre el extremo 5′ de una de las moléculas con el extremo 3′ de la otra. Esta reacción es catalizada por enzimas llamadas ADN ligasas. La ligasa más ampliamente usada es la T4 ligasa, esta enzima permite unir fragmentos con extremos romos o cohesivos complementarios. La reacción necesita de un medio iónico debido a que la enzima T4 es sensible a pequeñas variaciones en la concentración de sal, además la enzima requiere ATP como cofactor.

Material

1. ADN inserto
2. Plásmidos
3. Tubos de 1.5 mL
4. Gradilla para tubos de 1.5 mL
5. Guantes
6. Micropipetas
7. Hielo
8. Mezclador con calor (tipo Thermomixer)

Reactivos

1. Enzimas de restricción
2. Buffer para enzimas
3. T4 ligasa
4. Agua ultra pura libre de nucleasas

Procedimiento 

1. Se coloca en una gradilla un tubo de 1.5 mL y se adiciona:

NOTA: esta reacción se prepara sobre hielo.

2. Se mezcla suavemente con una pipeta y se centrifuga brevemente

3. Se coloca el tubo en el thermomixer y se incuba la reacción a 14-16 °C toda la noche o a temperatura ambiente durante 2 horas. NOTA: alternativamente, puede usarse una alta concentración de ADN ligasa de T4 en una ligadura de 10 minutos) .

4. Al terminar la incubación inactive la enzima con calor a 65 ° C durante 10 minutos.

5. Enfríe sobre hielo y transforme 1-5 μl de la reacción en 50 μl de células competentes.

Nota: La reacción de ligación de extremos cohesivos se lleva a cabo a una temperatura de 12o a 16oC para mantener un balance entre el alineamiento de los extremos cohesivos del ADN y la actividad de la enzima.