Método: extracción de proteínas en gel para la identificación por espectrometría de masas (MALDI o LC-MS/MS)

Introducción

Una preparación adecuada de una muestra de proteína, es requerida antes de un  análisis de espectrometría de masas (MS por sus siglas en ingles), métodos de separación o enriquecimiento de proteínas mediante geles de poliacrilamida de una o dos dimensiones (1D o 2D SDS-PAGE respectivamente), cromatografía líquida o captura de afinidad. Posteriormente, se deben digerir las proteínas en péptidos, comunmente aplicando una digestión enzimática (tripsina es la enzima más comúnmente usada) antes del análisis de MS. NOTA: se pueden usar diversas enzimas o digestiones químicas (para más información ver abajo).  

El uso de la MS es una herramienta fundamental en el estudio de la bioquímica de proteínas y en el análisis del proteoma. Las estrategias utilizadas para preparar las proteínas o muestras proteómicas en su mayoria implican muchos pasos, pero a diferencia de estos existen procedimientos como el método llamado “shutgun proteomics”, el cual, es relativamente más sencillo implicando menos pasos como: la extracción de proteínas, la digestión (por digestión química o enzimática) y por último el análisis de MS.

Generalmente, la mayoría de los equipos de espectrometría de masas disponibles comercialmente se pueden usar para analizar la mayoría delas muestras de péptidos y proteínas. Sin embargo, la elección del instrumento adecuado dependerá del presupuesto/costo, la disponibilidad, la facilidad de uso y el rendimiento que se requiera para la muestra que se habrá de analizar. Los tipos más comunes de analizadores de masas incluyen el tiempo de vuelo (TOF por sus siglas en inglés), el cuadrupolo y la trampa de iones. El analizador por TOF es capaz de detectar masas muy altas (300,000 Da),  siendo adecuada la ionización tipo MALDI que, típicamente genera especies con carga única. Las trampas de iones generalmente están limitadas a rangos de masa más pequeños (de 2,000 Da a 4,000 Da) y son adecuadas para equipos ESI, que genera especies de cargas múltiples, lo que permite detectar iones de gran masa en sus valores m/z más bajos. Aunque, las trampas de iones más comunes tienen un poder de resolución más bajo que los analizadores TOF, el Orbitrap (Thermo) rompe con esta regla y ofrece una resolución de masa de hasta 100,000 Da.

Material

1. Micropipetas
2. Puntas
3. Tubos de 1.5 mL
4. Navaja de bisturí
5. Vortex
6. Gradilla para tubos
7. Termomixer
8. Centrifuga con vacio

Reactivos

1. Hielo
2. Gel de primera o segunda dimensión teñido
3. Coomassie
4. Agua ultrapura
5. Acetonitrilo ultrapuro
6. Bicarbonato de amonio
7. Ditiotreitol
8. Iodoacetamida
9. Agua libre de proteasas
10. Enzimas para espectroetría de masas
11. Ácido trifluoroacético
12. Matriz para MS tipo MALDI
13. Ácido fórmico

Procedimiento

Obtención de la banda o Spot del gel

1. Corte la banda de interés en el gel de 1D (con una navaja de bisturí) o el punto en el gel de 2D (con una punta de pipeta recortada) teñido previamente con Coomassie convencional, Coomassie coloidal o Tinción de plata; y coloque la muestra en un tubo nuevo de 1.5 mL. NOTA1: use una tinción de plata sin glutaraldehído. NOTA2: el uso de dispositivos automatizados suelen cortar pedazos pequeños de la región de interés por lo que pueden ser insuficientes para un análisis exitoso de MS. 
2. Lave la muestra y agitarla 3 veces con agua ultra pura
3. Agregue 1 mL de disolución de desteñido (acetonitrilo 50% y bicarbonato de amonio 2.5 mM )
4. Deje la muestra en agitación hasta que se vea el pedazo del gel transparente. NOTA: cambiar la disolución de ser necesario 
5. Agregue 100 µL de acetonitrilo al 99.99% y agitarlo durante 10 min. NOTA: repetir este procedimiento dos veces. 
6. Retire el acetonitrilo y dejar evaporar durante 10-15 min.
7. Agregue 30 µL de Ditiotreitol (DTT) a 15 mM y dejarla incubando a 55°C durante 30 min. NOTA: esa reacción es de reducción
8. Retire el DTT y adicionar 30 µL de Iodoacetamida a 100 mM durante 30 min a temperatura ambiente. NOTA: esta reacción es de alquilación 
9. Retire la Iodoacetamida y adicione 100 µL de acetonitrilo al 99.9%
10. Agite la muestra durante 20 segundos y retire el acetonitrilo
11. Agregue bicarbonato de amonio 50 mM e incube a temperatura ambiente durante 10 min. NOTA: esta reacción es de neutralización 
12. Retire el bicarbonto de amonio y adicione 100 µL de acetonitrilo al 99.9% y deshidrate la muestra por 5 min. a temperatura ambiente.
13. Lleve su muestra a sequedad en una centrífuga con vacio durante 2-5 min.

Digestión enzimatica

1. Agregue 10 µL de una disolución de tripsina y deje sobre hielo durante 30 min. agite frecuentemente con un vortex durante este tiempo. NOTA: agite al menos dos veces, puede usar otro tipo de enzimas dependiendo de la naturaleza de sus proteínas. 
2.  Retire el sobrenadante y agregue de 10 a 15µL de H₂O o hasta que quede cubierto el gel e incube a 37°C toda la noche

Extracción

1. Prepare una disolución de ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1% con agua ultra pura (disolución 1)
2. Prepare una disolucion de TFA al 0.1% (v/v) con acetonitrilo al 50% (v/v) (disolución 2)
3. Prepare una disolución de TFA al 0.1% (v/v) con acetonitrilo al 75% (v/v) (disolución 3)
4. Agregue 50 µL de disolución 1 a su muestra previamente digerida  y agite en vortex durante 45 min.
5. Recupere el sobrenadante y coloquelo en un tubo nuevo. NOTA: en el sobrenadante vienen los peptidos de la muestra de gel 
6. Agregue 50 µL de disolución 2 y agite en vortex durante 20 min.
7. Recupere el sobrenadante y coloquelo en el mismo tubo anterior (paso 5)
8. Agregue 50 µL de disolución 3 y agite en vortex durante 20 min.
9. Recupere el sobrenadante y coloquelo en el mismo tubo
10. El sobrenadante recuperado debe evaporarse en una centrífuga con vacio (Savant) hasta llevar a sequedad
11. Se resuspenden los peptidos en 4 µL de Matriz. NOTA: la matriz debe ser usada si se analizará en un espectrometro tipo MALDI-TOF
12. Si la muestra ira a un MS/MS se resuspende en 4 µL de agua/ácido fórmico 0.1% (v/v)

Matriz

1. Tome 50 µL de la matriz que se encuentra saturada en una disolución de ácido α-ciano-4-hidroxicinamico
2. Prepare 1000 µL de acetonitrilo 50% (v/v)  TFA 0.1 % (v/v)
3. Agregue 150 µL de acetonitrilo/TFA  a los 50 µL de la matriz
4. Tome 2 µL y que resvale por las paredes del tubo de la muestra que llevó a sequedad
5. Coloque la muestra directamente sobre la placa del MALDI usando una micropipeta y deje que cristalice la matriz