Método: Diseño de primers con sitios de corte para clonación

Descripción

Los sitios de restricción se incorporan dentro de los primers 5′ (directo) y 3′ (inverso) cuando se amplifica un gen blanco mediante PCR. La elección del sitio de restricción en los primers es muy importante para que pueda ser incorporado en la posición correcta dentro de un plásmido. La clonación basada en PCR es versátil y permite que cualquier fragmento de ADN se coloque en cualquier vector de su elección con mínimas limitaciones. En general, el primer debe contener alrededor de 15-18 pb de secuencia del gen blanco que es requerido para realizar la PCR. Pero además, debe agregar el sitio de restricción en el extremo 5 ‘ del primer más una secuencia aleatoria de 6 pb para asegurar que la enzima de restricción pueda cortar eficiente al ADN.

Materiales

• Computadora
• Secuencia del vector
• Secuencia del gen
• Secuencia de las enzimas
• Software para visualizar los primers (SnapGene)

Procedimiento

1. Busque la secuencia de su vector en una base de datos de su elección y descargue su secuencia en formato fasta
2. Abra el software SnapGene en “New DNA File” y corte y pegue dentro del recuadro blanco la secuencia, si esta en formato FASTA borre el encabezado o “header” 
3. Si es todo un plásmido marque en la topología que es circular, si es un fragmento de una secuencia de ADN coloque que es lineal
4. NOTA: si su gen lo quiere usar para expresión de proteínas coloque la secuencia CDS. Si no conoce la secuencia CDS le recomendamos haga una busqueda https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/CCDS/CcdsBrowse.cgi
5. Asegurese de que tiene codon de inicio y de paro, para más información ver: Gen: Desde el código genético hasta la ingeniería genética
6. Agregue un nombre/título para su archivo (ej.: Gen1) y de continuar (OK). NOTA: se verá un recuadro verde donde especifique la longitud de la secuencia en número nucleótidos
7. Aparecerá en una ventana el mapa de la secuencia con diferentes sitios de corte, junto con los codones de inicio y de paro
8. De un click en la parte inferior izquierda en la pestaña de secuencia
9. Coloque el puntero en el inicio del codón de inicio y arrastre el puntero dejando apretando el botón izquierdo del mouse o doble click en su mouse pad, hasta 55-60°C de Tm (melting temperature).
10. Suelte el botón izquierdo y vaya a la parte superior donde dice Primers y seleccione add primers
11. Seleccione Top strand y observe que la dirección de la amplificación de su primer 5′ a 3′ sea la correcta
12. Nombre su primer y verifique el tamaño del primer y su porcentaje de GC sea el adecuado (≥18 nt y ≤50% GC) y las Tm sean las mismas para ambos Primers 
13. Copie la secuencia de su primer y colóquela en un archivo ex profeso  (*.txt, *.doc)
14. Coloque de ser necesario un color y una descripción de ese primer
15. Repita los pasos 8 al 14 pero empezando por el codón de paro y colocando bottom strand 
16. No olvide etiquetar bien en su documento nuevo las secuencias y su dirección Fw y Rev (forward and reverse)
17. Teniendo una su hoja de texto coloque títulos a sus primers, estos primers iniciales son para las primeras amplificaciones
18. Coloque otra línea con nuevos títulos agregando el sitio de restricción de su interés ej. Primer1_BamHI, Primer2_HindIII).
19. Agregue manualmente el sitio de corte del primer1 a lado de codón de inicio (si queremos colocar BambHI busque la secuencia y colóquela en la dirección correcta 5′-3′ https://international.neb.com/products/r0136-bamhi#Product%20Information. NOTA: si olvidó copiar las secuencias de doble click en el primer coloreado  
20. Realice el mismo procedimiento para su primer2
21. Coloque de 5-6 nucleótidos aleatoriamente antes de sus secuencia de Primer1_BamHI y después de su secuencia Primer2_HindIII. NOTA: si no coloca estas secuencias su enzima no podrá cortar el sitio de corte 
22. Después de colocar la secuencia del Primer2 es importante que saque su reverso, puede realizarlo con la ayuda de este programa https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html 
23. Teniendo el reverso corte y pegue toda su secuencia de interés original (FASTA sin encabezado al documento) y coloquele un título ej.: Gene1
24. Posteriormente coloque las secuencias con los sitios de corte y los nucleótidos aleatorios
25. Verifique su secuencia completa agregandola nuevamente a SnapGene paso 2 y renombre su archivo Gen1_sitios de corte
26. Observe el mapa de su gen y verifique que se armó correctamente y se observan los sitios de corte
27. Diseñe primers agregando los sitios de corte como se indican en el punto 9 en adelante.
28. Cuando realice sus amplificaciones empiece con los primers 1 y 2 y cuando obtenga una banda limpia y clara realice un segundo round de PCR con los primers que contienen los sitios de corte.
29. Para ligar su secuencia en un plasmido le recomendamos seguir el siguiente protocolo http://conogasi.org/articulos/metodo-ligamiento-con-t4-adn-ligasa/