Genotipificación por secuenciación Sanger

Conocimientos previos

Secuenciación Sanger
Secuenciación de alto rendimiento
Genotipo  y Fenotipo
Haplotipo
SNP
Variación genética

Descripción

Entrada/Muestra

Secuencia de métodos

1. Método de  Extracción de ADN  o

2. Método de  Extracción de ARN total NIVEL: INTERMEDIO

2.1  Método de  Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc NIVEL: INTERMEDIO    

2.2  Método  Electroforesis (gel de agarosa y poliacrilamida) NIVEL: INTERMEDIO 

3. Método de  PCR Nivel intermedio

4. Método de  Electroforesis (gel de agarosa y poliacrilamida) NIVEL: INTERMEDIO

5. Purificación de banda: en este paso se recorta una sección del gel y se procede a su purificación. Es recomendable cargar dos muestras en el mismo gel, una marcada con bromuro de etidio y otra no (que será recortada). Esto evitará conflictos con los métodos subsecuentes. Por lo general se utilizan métodos comerciales para su purificación, de empresas como: Qiagen, Promega, Biotools, Invitrogen, etc.

6. Método de Cuantificación del ADN: se mide la concentración de ácidos nucleicos (ADN o ARN ) o proteínas en una muestra y se agrega una cantidad determinada por el usuario.

7. Método  Secuenciación convencional (Sanger) NIVEL: INTERMEDIO

8.Análisis de la secuencia y sus variaciones (Bioinformática): puede hacerse de manera manual en el caso de pocas muestras; en caso contrario, se emplean herramientas bioinformáticas para la visualización de las secuencia del gen,  alineamientos múltiples de las secuencias, BLAST de múltiples secuencias, árboles filogenéticos, softwares de análisis de variaciones (ej.: SVAMP), etc.) y gráficos como Weblogo para ayudar a mejorar la observación de los sitios conservados y no conservados.

Salida/Resultado
Secuencia de un gen o un fragmento de ADN o ADNc con los análisis de sus variaciones.

Procesos alternativos

Genotipifiación por microarreglo

Genotipificación por secuenciación de alto rendimiento

Aplicaciones

Filogenia

SNPs

Ancestria

Farmacogenómica

Diagnostico clínico

Temas relacionados

Filogenética

Detección de variantes

Genotipificación de ADNmt

Notas

Si no se cuenta con el tiempo para mandar secuenciar la muestra, se pueden utilizar  enzimas de restricción (proteínas que cortan sitios específicos de secuencias de ADN y dan un patrón de bandeo correspondiente a un fenotipo), pero es necesario correr la muestra junto con un control positivo que dé el patrón de bandas esperado en el gel.