Extracción de ARN total

Conocimientos previos

Célula
ARN
Expresión génica
Transcripción de ADN

Descripción

Es un método por el cual se aísla este tipo de material genético utilizando técnicas físicas y químicas. La extracción consiste en la separación de polímeros de ARN con el fin de poder estudiarlo, analizarlo o manipularlo. Para lograr dicha separación se usan generalmente solventes orgánicos como fenol y cloroformo. En la investigación biomédica se suele utilizar como un paso previo para separar y estudiar los   ARN mensajeros (ARNm, ver Método aislamiento del ARNm) y así conocer la expresión génica (ver Método qPCR) en una enfermedad o en alguna condición de interés.

Entrada/Muestra

Material biológico (células, tejido , etc)

Recursos/Material

Material biológico: Células, tejidos, órganos o fluidos corporales
Proteasas: sirven para la degradación de proteínas que se unen al ARN.
Solventes orgánicos:  soluciones que diluyen a un soluto y permite la dispersión de otras sustancias para su separación.
DNAsa I: enzima que degrada cadenas de  ADN .
Centrífuga: equipo que ayuda a acelerar el proceso de separación de componentes de diferentes densidades mediante la rotación de una muestra.
Espectrofotómetro: equipo que sirve para medir la concentración de ácidos nucleicos como el ARN.

Requisitos previos

ARN total

Procedimiento

Obtención del  material biológico
Lisis celular: es el proceso físico o químico por el cual se rompe la membrana celular y nuclear.
Degradación de proteínas: se rompen las proteínas que interactúan con el  ARN .
Proceso de Separación: procesos físicos (centrífuga) o  químicos  ( solventes) mediante los cuales se aíslan y separan diferentes componentes celulares como lípidos, proteínas, ARN , ADN , moléculas pequeñas.
Degradación de ADN por DNAsa I: proceso que rompe específicamente cadenas ADN con el fin de evitar contaminación de este material.
Solubilización del ARN: se diluye el ARN en un volumen conocido de agua ultra pura.
Cuantificación de ARN: proceso mediante el cual se mide la concentración del material genético mediante un espectrofotómetro.

Salida/Resultado

Moléculas de  ARN  total que consisten en: ARN ribosomal, ARN transferencia,  ARN mensajero , ARN perqueños, microARNs provenientes de nuestro material biológico.

Fuentes de error más frecuentes

Poco material biológico

Alta concentración de RNAsas presentes en la muestra

Mala calidad del ARN total

Errores comunes en las técnicas de biología molecular

Aplicaciones

Aislamiento de ARNm

Aislamiento de micro

RNAsExpresión génica

 PCR en tiempo real

Transcriptoma por Microarreglos

Transcriptoma secuenciación masiva

Secuenciación  de exones (Exoma)

Espliceosoma

Temas relacionados

Extracción de ADN 

Electroforésis

Espectrofotometría 

Notas

Todos los materiales que se usan para este método deberán estar químicamente limpios y  estériles, con el fin de evitar la degradación del ARN.

Para hacer alguna de las aplicaciones es necesario checar la calidad del ARN realizando un gel de electroforesis de agarosa. Se observarán 3 bandas abundantes y un barrido (bandas: ARN ribosomales 25S, 18S, 5S y un barrido que son ARN mensajeros de diversos tamaños). En geles de poliacrilamida se pueden llegar a observar otras bandas más pequeñas como ARN pequeños y microARNs.