Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc

Conocimientos previos

Transcripción
Extracción de ARN total
ARN
ARNm
Procesamiento de ARNm
Descripción

Este método consiste en aislar, o separar, el ARN mensajero (ARNm) a partir de una muestra de ARN total. El ARNm tiene en el extremo de su secuencia una estructura llamada poli-A, que es una secuencia repetida de un nucleótido llamado adenina. Para que el aislamiento se lleve a cabo, se agrega una secuencia corta de repetidos de timinas, llamada oligo-dt, que se une al poli-A. Después, usando una proteína llamada transcriptasa reversa (o RT) se genera una cadena de ADN llamado complementario (ADNc). Esta cadena de ADNc es posteriormente usada en otras técnicas de biología molecular. En investigación biomédica esta técnica puede usarse para estudiar enfermedades  1.
Entrada/Muestra

ARN total: Este se obtiene a partir de la extracción de una muestra biológica.
Recursos/Material

ARN total:  se obtiene a partir de la extracción de una muestra biológica (ver Método extracción de ARN total).

Oligo-dT: secuencia de alrededor de 18 nucleótidos de timina 5’-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3’

Transcriptasa reversa (RT): proteína que tiene como función generar una secuencia de ADNc utilizando como molde ARNm.

dNTPs: son nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de ADN.

Iones: son elementos químicos necesarios para la función de la proteína RT.

Termociclador: aparato que eleva y baja la temperatura en tiempos cortos para poder llevar a cabo la reacción de Transcripción reversa.

RNAsa: proteína que rompe cadenas de ARN con el fin de evitar contaminación de este material.

Espectrofotómetro: equipo que sirve para medir la concentración de sustancias.
Requisitos previos

ARN total.
Procedimiento

Unión del oligo-dT: El oligo-dT reconoce  secuencias repetidas de adenina (poli-A) que se encuentran en un extremo del ARNm; esto se realiza subiendo la temperatura a  ̴42 °C

Transcripción: se agrega la proteína transcriptasa reversa (RT) y se sube la temperatura alrededor de 40-65°C; la enzima comienza a transcribir el ARNm a ADNc.

Desnaturalización de la proteína RT: se usan temperaturas altas (85°C) para desactivar la proteína (RT), ya que el calor rompe la estructura proteica y por lo tanto su función.

Degradación del ARN:  se rompen las cadenas de ARN sobrantes usando una proteína llamada RNAsa para evitar contaminación de este material.

Cuantificación de ADNc: se cuantifica la cantidad de ADNc obtenido con un equipo llamado espectrofotómetro.
Salida/Resultado

Moléculas de ADNc provenientes del ARNm aislado de una muestra de ARN total. Estos ADNc son usados generalmente para realizar PCR, qPCR o para el análisis de transcriptomas.
Fuentes de error más frecuentes

Calidad del ARN

Baja concentración de ARN

Contaminación con ADN

Alta concentración de sales

Errores comunes en las técnicas de biología molecular
Métodos alternativos

NA
Aplicaciones

PCR

qPCR

Microarreglos

Trancriptomas (secuenciación masiva)
Temas relacionados

Extracción de ARN total.
Notas

Los ADNc son usados generalmente para realizar PCR, qPCR o para el análisis de  transcriptomas