Electroforesis en gel

Conocimientos previos

• Extracción de ADN
• PCR
• Proteínas
• Extracción de proteínas

Descripción

La electroforesis es un método por el cual se separan  moléculas por tamaño o peso molecular usando una corriente  eléctrica. La separación se realiza comúnmente en un  gel  que funciona como filtro y está constituido habitualmente de materiales como agarosa o poliacrilamida. Su principal uso es la separación de mezclas de macromoléculas, especialmente de ácidos nucleicos (ADN o ARN) o proteínas. Los ácidos nucleicos disponen de una carga eléctrica negativa y cuando son  separados en el  gel se dirigirán al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan artificialmente con una sustancia llamada dodecilsulfato de sodio (SDS) que se incorpora a estas y les da una carga negativa. Al colocar una muestra de proteínas dentro del gel y al pasar una corriente eléctrica, éstas se moverán a través del gel dirigiéndose al polo positivo. Las  moléculas más pequeñas se moverán más rápidamente y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida en el gel .

Muestra: es una mezcla del mismo tipo de componentes proveniente de una extracción de ácidos nucleicos (ADN, ARN) o de proteínas.

Recursos/Material

• Solución amortigüadora de carga o “buffer” de carga: solución en la que se disuelve nuestra muestra.
• Gel de agarosa o poliacrilamida: polímero de algún material poroso que sirve para separar la muestra al aplicar corriente eléctrica. Dentro del gel se puede analizar desde 1 hasta 15 muestras dependiendo del equipo con el que se cuente.
• Solución amortiguadora de corrida o “Buffer” de corrida:  solución que cubre el  gel  y por la cual pasa una corriente eléctrica.
• Cámara de electroforesis: equipo en forma de caja de un material plástico. Contiene dos electrodos donde se conecta una fuente de poder. Dentro del equipo se colocan el gel y la disolución de corrida.
• Fuente de poder: aparato que genera una corriente eléctrica constante.
• Solución de tinción: mezcla de reactivos que tiñen la muestra dentro del gel.
• Escáner: aparato que permite almacenar digitalmente una imagen del gel teñido para su posterior análisis.

Requisitos previos

• Extracción de proteínas o extracción de ADN o extraccion de ARN total
• Aislamiento y sintesis de ADNc o productos de PCR

Procedimiento

• Cuantificación: Antes de separar nuestra mezcla de ADN , ARN  o proteínas es necesario medir la concentración de las muestras. Para agregar una cantidad igual de cada muestra y poder compararlas entre ellas posteriormente.
• Carga de muestra: la muestra se mezcla con el buffer de carga (específico para proteínas o para los ácidos nucleicos) y se coloca en un extremo del gel dentro de un hueco diseñado para colocar la muestra. Una vez depositada las muestras dentro del gel, se vierte el buffer de corrida hasta que el gel quede sumergido.
• Corrida: es el proceso por el cual se pasa una corriente eléctrica constante al gel (con las  muestras dentro y colocado el buffer de corrida dentro de la cámara). Después, se conecta la cámara de electroforesis a la fuente de poder y durante un periodo determinado por el usuario se deja pasar la corriente eléctrica, usualmente se corre a 70 V para un gel de agarosa y 25 mA para un gel de poliacrilamida durante una hora.
• Tinción: terminada la corrida, el gel es teñido con una solución específica para visualizar las moléculas separadas.Por lo general se usa azul de coomassie para la tinción de proteínas y bromuro de etidio o SYBR-green para ácidos nucleicos (ver métodos de tinción).
• Cuantificación de la muestra separada: posterior a la tinción el gel es escaneado y con la ayuda de un software se mide la concentración de las moléculas separadas individualmente y vistas como bandas (que asemejan una escalera).

Salida/Resultado

Un gel  con una mezcla de ADN, ARN o proteínas separadas. Las moléculas separadas lucen como múltiples bandas, distribuidas como ‘escalones’ a lo largo del gel.

Fuentes de error más frecuentes

• Calidad de la muestra
• Baja concentración de la muestra
• Alta concentración de sales
• Errores comunes en las técnicas de biología molecular

Aplicaciones

• Técnicas biotecnológicas
• Técnicas bioquímicas
• Filogenia
• Ancestría
• Genotipificación
• Ciencias Forenses
• Proteómica

Temas relacionados

• Métodos de tinción fluorescente para ácidos nucleicos: bromuro de etidio y SYBER Green
• Métodos de tinción para proteínas: coomassie, coomassie coloidal, nitrato de plata
• Métodos de tinción fluorescente para proteínas: SYPRO, DIGE, Pro-Q
• Método de cuantificación de ácidos nucleicos
• Métodos de cuantificación de proteínas
• Espectrofotometría
• Western blot
• Secuenciación convencional Sanger
• Espectrometría de masas: MALDI-TOF y LC-MS/MS
• Diagnóstico molecular
• Farmacogenómica

Notas

Todos los materiales y reactivos que se usan deberán estar químicamente limpios y estériles.  Además, deben estar libres de nucleasas (enzimas que degradan ADN o ARN) o proteasas (enzimas que degradan proteínas) con el fin de evitar daño a la muestra. Las muestras separadas y embebidas en el gel pueden observarse a simple vista en el caso de una tinción colorida (en proteínas, ver Método tinción Coomassie), pero en el caso de ácidos nucleicos o tinciones fluorescentes es necesario observar el gel con un escáner especial (ver Métodos de tinción Fluorescente para ácidos nucleicos o Métodos de tinción Fluorescentes para proteínas).