Método: aislamiento de células sanguíneas por gradiente de Ficoll-Paque

Descripción

Ficoll-Paque es un medio en gradiente de densidad comúnmente usado para aislar células mononucleares provenientes de sangre periférica humana, utilizando un procedimiento de centrifugación basado en el método desarrollado por Bøyum (Bøyum, A., Scand. J. 1968). La separación de las células de sangre periférica humana normal generalmente se obtienen:
• 60 ± 20% de recuperación de las células mononucleares presentes en la muestra de sangre original
• 95 ± 5% de células mononucleares
•> 90% de viabilidad de las celdas separadas
• Máximo 5% de granulocitos, parte inmediata superior a los eritrocitos
• Máximo 10% de eritrocitos, parte baja del tubo

Los linfocitos, monocitos y plaquetas no son lo suficientemente densos para penetrar en las capas del medio de Ficoll-Paque. Estas células, por lo tanto, se reúnen como una banda concentrada en la interfase de la muestra. Esta banda permite aislar las células mononucleares para ser recuperadas con un alto rendimiento en un pequeño volumen.

Materiales

• Guantes de latex
• Tubos de ensayo de 15mL
• Jeringas con aguja
• Ligadura
• Aguja Intravenosa
• Algodón
• Etiquetas
• Plumón indeleble/Marcadores indelebles
• Pipetas serológicas estériles
• tubos cónicos estériles
• Centrífuga
• Campana de flujo laminar
• Botellas de cultivo o platos
• Incubadora
• Contenedor de objetos punzantes

Reactivos

• Alcohol 95%
• Tubos con anticoagulantes
• Heparina
• EDTA
• Ficoll-Paque
• PBS o solución fisiológica
• Medio de cultivo
• Hipoclorito de sodio

Procedimiento para la extracción de la sangre periférica

1. Lávese las manos y colóquese los guantes de látex antes de cualquier procedimiento
2. Coloque la ligadura entre 7-8 cm por encima del punto de punción de la persona que le donara su sangre. NOTA: explíquele el procedimiento que realizará y verifique su estado de salud.
3. Cuando la vena este prominente palpe con el dedo y observe su tamaño, dirección y profundidad. NOTA: la vena más utilizada se localiza en la fosa antecubital.
4. Desinfecte la zona elegida con alcohol u otro antiséptico para evitar la contaminación bacteriana. NOTA: deje secar el alcohol o el paciente sentirá una sensación de quemazón.
5. Inmovilice la vena utilizando su pulgar de bajo de la zona de punción y tense la piel, esto evitará que la vena se escurra. NOTA: evite que el donante haga movimientos 
6. Con el bisel hacia arriba puncione la piel y proceda a realizar la punción con un movimiento rápido y firme en un ángulo <45° aproximadamente. NOTA: compruebe que la aguja no contenga bordes ásperos o toscos, pero nunca la toque. 
7. Cuando la aguja está asegurada aspire la jeringa usando el émbolo para que la sangre fluya y retire el torniquete. NOTA: si usa vacutainer use tubo con anticoagulante
8. La sangre desfibrinada o tratada con anticoagulante (EDTA: 1.8 mg/mL de sangre o Heparina 0.3 mL a 1000 U) se diluye con un volumen de 1:1 (v/v) de una solución salina pH 7.4 o PBS
9. Mezcle y homogenice suavemente por inversión
10. Después coloque un tubo con 3 mL de Ficoll

Procedimiento para la separación de células mononucleares

1. Dentro de una campana de flujo vertical use una pipeta pasteur o serológica y coloque con mucho cuidado 4 mL de sangre diluida (sin mezclar) sobre el tubo que contiene Ficoll-Paque
2. Centrifugue a 400 x g durante 30 minutos. La centrifugación da como resultado la formación de capas que contienen diferentes tipos celulares:
   – La capa inferior contiene eritrocitos, que han sido agregados por el Ficoll-Paque
   – La capa inmediatamente superior a la capa de eritrocitos contiene principalmente granulocitos, que a la presión osmótica de la solución de Ficoll-Paque, alcanza una densidad lo suficientemente alta como para migrar a través de la capa de Ficoll Paque.
   – En la interfase entre el plasma y la capa Ficoll-Paque, se encuentran las células mononucleares se encuentran junto con otras partículas con baja densidad que se van sedimentando lentamente  (por ejemplo, plaquetas) .
3. Cuando termine de centrifugar, coloque sus tubos dentro de la campana y tome la interfase para las células mononucleares
4. Coloque las células en un tubo cónico y centrifugue a 500 x g durante 10 minutos. NOTA: Una centrifugación a altas velocidades aumenta la recuperación de células mononucleares. Pero, si también es importante eliminar las plaquetas, se recomienda bajar la velocidad de centrifugación (60 a 100 × g) .
5. Coloque las células en botellas con medio de cultivo apropiado
6. Puede continuar posteriormente con los métodos de Conteo y Viabilidad celular, Criopreservación, Descongelación celular, o métodos de citogenética como: Cariotipos, Bandas G, etc.
7. Descarte el material que no utilizará colocándolo en una solución de Hipoclorito de Sodio (NaOCl) al 0.5%.

Procedimiento para la separación de granulocitos

1. Realice la centrifugación de la sangre diluida usando el gradiente de densidad de Ficoll-Paque como se describió anteriormente
2. Extraiga todas las capas superiores con una pipeta estéril, dejando únicamente la capa de células blancas de granulocitos sin perturbar que está por encima de la capa de glóbulos rojos
3. Recoja la fina capa de glóbulos blancos de granulocitos con una pipeta y transfiera a un tubo cónico estéril
4. Resuspenda las células en al menos cinco volúmenes de PBS pH 7.4 y centrifugue a 400 × g durante 10 minutos.
5. Elimine los glóbulos rojos restantes con cualquier solución de lisis de glóbulos rojos de su elección
6. Centrifugue los granulocitos a 400 a 500 × g durante 10 a 15 minutos a 18 °C a 20 °C
7. Retire el sobrenadante.
8. Resuspenda los granulocitos en 6 a 8 mL de PBS o solución salina equilibrada
9. Centrifugar a 400 a 500 × g durante 10 minutos a 18 ° C a 20 ° C.
10. Retire el sobrenadante
11. Resuspenda el sedimento celular en un medio de cultivo apropiado
    

    NOTA:

    Los Anticoagulantes que pueden usarse son: heparina, EDTA, citrato, citrato de ácido dextrosa (ACD) y citrato fosfato dextrosa (CPD) para la muestra de sangre. La sangre desfibrinada no requiere anticoagulante. La desfibrinación, sin embargo, da como resultado un menor rendimiento de células mononucleares y puede causar una mayor contaminación por los glóbulos rojos. También causa la pérdida selectiva de monocitos. Bøyum ha descubierto que se obtiene una preparación de células mononucleares más pura usando EDTA en lugar de heparina como anticoagulante (Bøyum, A. 1976).  También se ha observado en la purificación de células mononucleares de fuentes distintas a la sangre periférica que la adición de heparina puede provocar la gelificación en la suspensiones celulares (Almeida, A.P. 1980). La sangre estabilizada con citrato puede dar como resultado una mejor calidad de ARN y ADN que otros anticoagulantes, y producir un mayor rendimiento de células mononucleares. La heparina afecta la proliferación de células T y se une a muchas proteínas. EDTA es bueno para los ensayos basados ​​en ADN, pero influye en la concentración de Mg2 + y causa problemas para el análisis citogenético (Holland, N.T. 2003). También se ha demostrado que el rendimiento de ARN es mayor en EDTA-sangre que en heparina-sangre (Marteau, J. 2005).