Método: Extracción de ADN genómico (procariontes)

Introducción

A todo el material genético dentro de una célula se le llama genoma. En procariontes el genoma suele estar conformado por dos tipos de moléculas de DNA: cromosomas y
plásmidos. Se le considera como cromosoma a la molécula de DNA que codifica la mayor parte de las funciones básicas para que la bacteria viva, y su tamaño suele ser extremadamente grande. Por otro lado, los plásmidos son moléculas de DNA de menor tamaño (comparado con el cromosoma) que suelen codificar funciones accesorias para la bacteria. También existen plásmidos que contienen genes esenciales para la supervivencia bacteriana. Aunque la distinción entre ambas tradicionalmente ha sido arbitraria.

El análisis del genoma bacteriano invariablemente requiere de la obtención del DNA en una cantidad y calidad adecuada. Para cumplir este fin, se han diseñado diferentes técnicas las cuales básicamente buscan lisar suavemente a las células y solubilizar su DNA. Posteriormente se remueven los contaminantes (nucleasas, proteínas, lípidos, polisacáridos) para finalmente
concentrar el DNA. La técnica que a continuación se describe es la más ampliamente utilizada y se distingue por el uso de solventes orgánicos que ayudan a eliminar los contaminantes protéicos.

Procedimiento

1) Inocular 5 ml de medio de cultivo con la cepa de interés e incubar 12 h a 300 rpm
2) Centrifugar el cultivo a 10 000 rpm durante 1 min. Descartar el sobrenadante
3) Resuspender la pastilla celular en 1 ml de solución TE 50:20, pH=8.0 con ayuda del vortex. El TE elimina cationes divalentes y lava el exceso de medio de cultivo
4) Centrifugar a 10 000 rpm durante 1 min y descartar el sobrenadante
5) Resuspender la pastilla celular en 0.4 ml de TE 50:20 con la ayuda del vortex
6) Adicionar 50 μl de SDS al 10% y 50 μl de proteinasa K a 2.5 mg/ml. Mezclar por inversión varias veces e incubar a 37 °C durante 1 h. El SDS es un detergente que lisa la membrana bacteriana, mientras que la proteinasa K digiere proteínas
7) Transferir el lisado claro a una jeringa (con aguja del No. 20) y hacerlo pasar a través de la aguja 5 veces
8) Repetir la operación anterior pero esta vez usando una aguja del No. 25. Cuando se hace pasar la solución a través de las agujas se logra romper complejos macromoleculares en los que se encuentra atrapado el DNA. Con esta acción parte del DNA se rompe, aunque el daño no es suficiente para interferir con su análisis
9) Adicionar 0.5 ml de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (24:24:1) y mezclar con el vortex La mezcla fenol-clorofomo elimina el agua contenida en la fase orgánica. El alcohol isoamílico ayuda a la separación de la fase orgánica de la acuosa
10) Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 min. Recuperar la fase acuosa, repetir la operación anterior (paso 9) y centrifugar nuevamente (10 000 rpm, 10 min)
11) Recuperar la fase acuosa y adicionar 2 volúmenes de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Con este paso se pretende eliminar completamente al fenol debido a que oxida al DNA
12) Recuperar la fase acuosa y adicionar 1/10 del volumen de acetato de potasio 3M y 2 volúmenes de etanol absoluto. Mezclar con ayuda del vortex y centrifugar a 10 000 rpm y 4 oC
durante 10 min. El DNA es insoluble en etanol y acetato favorece la precipitación de los ácidos nucleicos
13) Retirar el sobrenadante y adicionar 1 ml de etanol al 70 %. Con el etanol al 70 % se lava el exceso de sal contenida en la muestra
14) Resuspender con vortex, centrifugar 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Repetir una vez más el lavado

15) Retirar todo el sobrenadante y secar con ayuda del DNA speed vac (alternativamente se pueden dejar los tubos abiertos hasta que todo el etanol se evapore)
16) Resuspender en 100 μl de TE-RNasa (50 μg/ml) y analizar la preparación de DNA en un gel de agarosa al 1 %. El DNA obtenido puede ser utilizado como templado para reacciones de PCR

SOLUCIONES
Tris 1M pH 8.0
Tris 30.28 g
H2O Aforar a 250 ml. Ajustar pH con HCl, filtrar y esterilizar por autoclave.

EDTA 0.25M pH 8.0
EDTA (disódico) 23.3 g
H2O Aforar a 250 ml. Ajustar pH con NaOH 1M, filtrar y esterilizar por
autoclave.

TE 10/1 pH 8.0
Tris 1M 5 ml
EDTA 0.25M 2 ml
H2O Aforar a 500 ml. Esterilizar por autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.

TE 50/20 pH 8.0
Tris 1M 25 ml
EDTA 0.25M 40 ml
H2O Aforar a 500 ml. Esterilizar por autoclave. Almacenar a temperatura ambiente

SDS 10%

SDS 1 g
H2O Aforar a 10 ml. Disolver con mosca magnética a velocidad baja. Almacenar a temperatura ambiente

RNasa [50 μg/ml]
RNasa 50 mg
H2O milliQ 1 ml. Disolver y calentar a 95 ºC por 10 min. Almacenar a -20 ºC.

Acetato de potasio (CH3CO2K) 3M
CH3CO2K 2.94 g
H2O milliQ Aforar a 10 ml. Disolver y filtrar con membrana de 0.22 μm. Almacenar a temperatura ambiente

NaOH 1M
NaOH 9.9 g
H2O Aforar a 250 ml. Agregar el NaOH lentamente

Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico
Fenol 24 ml
Cloroformo 24 ml
Alcohol isoamílico 1 ml Almacenar en frasco ámbar a 4 ºC