Secuenciación de alto rendimiento (Pirosecuenciación e Illumina)

Conocimientos previos

Secuenciación convencional
Genoma
Genómica
PCR
qPCR
Descripción

La secuenciación de alto rendimiento, también llamada ‘de nueva generación’ o secuenciación masiva, es un método multidisciplinario (es decir, que emplea más de una ciencia como nanotecnología, robótica, informática, entre otras), y es usado para secuenciar de miles a millones de fragmentos de ADN  diferentes al mismo tiempo. Para llevarse a cabo, los fragmentos de ADN deben estar adheridos a una superficie que puede ser nanoesferas o una placa.

Para realizar la secuenciación es necesario utilizar una proteína llamada polimerasa y nucleótidos.  La secuenciación de alto rendimiento por placas utiliza nucleótidos marcados con colores fluorescentes que son agregados al ADN adherido a la placa. Al mismo tiempo, un dispositivo toma fotografías de cada adición.   Las fotografías permiten saber qué color se está agregando, es decir, qué nucleótido se agrega; así se logra conocer  la secuencia del ADN. En cambio, en el caso de las  nanoesferas  la secuenciación se lleva a cabo agregando los nucleótidos uno por uno. Conforme son añadidos, los nucleótidos emiten  una luz proveniente de una reacción llamada quimioluminiscencia. Al conocer qué nucleótido se va agregando es posible identificar la secuencia de ADN.

Una ventaja de la secuenciación de alto  rendimiento  es que, a diferencia de la secuenciación convencional, puede trabajar con muchísimos fragmentos de ADN en forma simultánea. Esto le permite tener una amplia gama de aplicaciones, lo que facilita a la investigación biomédica estudiar cualquier cuestión con relación al genoma de un  organismo. Estos  análisis dan indicios de procesos patológicos, ancestría y  diversidad genética , entre otros procesos biológicos de interés 1 2 3.
Entrada/Muestra

ADN o ARN total
Recursos/Material

Muestra biológica
Adaptadores: secuencias conocidas de nucleótidos que se unen en los extremos de los fragmentos de ADN y se encuentran adheridos a una superficie (nano-esferas o placas).
Soluciones amortiguadoras del kit o Buffer del kit: Solución acuosa que contiene una mezcla patentada de sus componentes, incluyendo polimerasa, nucleótidos y  enzimas encargadas de unir el ADN a la superficie.
Placas: material que provee el fabricante para generar copias de ADN y permitir su secuenciación.
Nanoesferas: estructuras esféricas de 20µm que contienen dos enzimas que servirán para detectar la secuencia de nucleótidos de nuestro ADN.
Secuenciador: equipo que permite llevar a cabo las reacciones de secuenciación y registro de imágenes por computadora.
Requisitos previos

ADN total proveniente de una muestra biológica.
Procedimiento

Fragmentación del ADN: el ADN se rompe en pequeños fragmentos.
Preparación de la muestra: dos pares de adaptadores (secuencias de ADN conocidas) son agregados en cada extremo de los todos los fragmentos de ADN.
Adhesión a la superficie: todos los fragmentos de ADN  (una sola cadena) son adheridos a una superficie ( nanoesfera  o placa).
Amplificación clonal in vitro; PCR: permite generar  múltiples copias de un mismo fragmento de ADN que se encuentra adherido a una superficie. Al terminar la reacción se obtienen múltiples copias de todos los fragmentos de ADN (_~2 millones de copias).
Secuenciación por pirosecuenciación (Nanoesferas): en el caso de las  nanoesferas , estas llevan a cabo dos reacciones químicas:  se añade un nucleótido  (dNTP: A, T, C, G uno por uno)  y se emite  una luz fluorescente cuando se une a la cadena de ADN; la reacción será detectada por una cámara. Así es como se conoce la secuencia del ADN y esta información se  almacena como texto en una computadora para su posterior análisis (ver Método bioinformático Secuenciación alto rendimiento) [2].
Secuenciación por síntesis (placas): se adicionan nucleótidos marcados con fluorescencia y cuando existe un apareamiento entre el  ADN y el nucleótido marcado se le toma una  imagen, la cual es almacenada como un archivo de texto. El proceso se repite para cada nucleótido hasta obtener la secuencia de los fragmentos.
Salida/Resultado

Archivos computacionales que contienen millones de secuencias de fragmentos de ADN de una muestra biológica. Estos resultados posteriormente pueden ser usados para ensamblar las secuencias utilizando herramientas bioinformáticas (ver Método Ensamble de genoma).
Fuentes de error más frecuentes

Calidad del ADN

Baja concentración de ADN

Alta concentración de sales

Errores comunes en las técnicas de biología molecular

Incremento de error en lecuturas de baja complejidad

Incremento de error para lecturas muy grandes

Alto ruido de trasfondo por el uso de fluorescencia

Incremento de error en lecuturas de baja complejidad
Métodos alternativos

Secuenciación de nueva generación (Iontorrent)

Secuenciación de nueva generación (Nanoporo o secuenciador de USB)
Aplicaciones

GWAS

Genotipificación

Filogenia

Ancestría

Metagenómica

Genómica Funcional

Farmacogenómica
Temas relacionados

Secuenciación de nueva generación (Iontorrent)

Secuenciación Epigenoma: Bisulfite-seq

Secuenciación Transcriptoma: RNA-seq

Diagnóstico molecular

Farmacogenómica
Notas

Los resultados deben analizarse mediante herramientas bioinformáticas (ver Método bioinformático: Secuenciación de alto rendimiento).