Secuenciación convencional (Sanger)

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Conocimientos previos  ADN Replicación del ADN Extracción de ADN PCR Electroforesis Descripción La secuenciación del ADN permite conocer el orden de los…

Conocimientos previos

 

  •  ADN
  • Replicación del ADN
  • Extracción de ADN
  • PCR
  • Electroforesis

Descripción

 

La secuenciación del ADN permite conocer el orden de los nucleótidos de un fragmento de  ADN  provenientes de una PCR. Para llevar a cabo este método es necesario utilizar una proteína llamada polimerasa de ADN, nucleótidos estándar y nucleótidos modificados (ddNTPs con marcaje fluorescente). Estos elementos producirán cadenas de ADN de diferentes longitudes, donde el último nucleótido será uno de los modificados.  El resultado de este método es un conjunto de fragmentos de ADN de diferentes longitudes, los cuales posteriormente serán separados por tamaño utilizando electroforesis (ver Método electroforesis) a través de  un tubo capilar. Durante la separación se va obteniendo la secuencia de cada fragmento de ADN al ir observando cada nucleótido marcado. En la investigación biomédica, la secuenciación se realiza para conocer las variaciones en la secuencia de un fragmento de ADN o un gen ( gene ) específico de un individuo; esto es esencial para realizar un diagnóstico de alguna enfermedad.
Entrada/Muestra

 

Banda purificada de un gel de electroforesis o producto purificado de la PCR.
Recursos/Material

 

ADN molde: es un fragmento purificado de ADN proveniente del método de PCR.
Iniciador o “Primer”: en este método sólo se usa una secuencia de nucleótidos que se ubican en uno de los extremos del ADN molde (véase también Método de PCR).
ddNTPs marcados: nucleótidos marcados con diferentes colores fluorescentes  para poder distinguir unos de otros.
Polimerasa: proteína que duplica el ADN deseado. Inicia el proceso de duplicación donde se ubica el iniciador; posteriormente la polimerasa avanza y agrega un ddNTP marcado al ADN molde para obtener ADN con un nucleótido marcado.
Secuenciador: equipo que separa e identifica secuencias de ADN de manera automatizada.
Requisitos previos

 

Método: Purificación de banda de un producto de PCR.
Procedimiento

 

Marcaje: el marcaje se lleva a cabo mediante ciclos de PCR, en los cuales se agregan los nucleótidos (marcados y no marcados). Conforme se completan estos ciclos, se generan diferentes tamaños de un fragmento de ADN, pues al unirse un nucleótido marcado a un fragmento, ese fragmento ya no puede crecer.
Electroforesis capilar: Después del marcaje se separan los fragmentos mediante electroforesis capilar, de la cual se obtienen cadenas de ADN de diferentes tamaños y que tienen en el último nucleótido una marca fluorescente. Estos fragmentos, al ser separados, permiten ordenar las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN desde el más pequeño hasta el más grande (ej. ATC, ATCG, ATCGG, ATCGGT,…). Mediante un dispositivo que realiza la detección de los nucleótidos marcados es posible conocer la secuencia del ADN (ATCGGT…).
Cromatograma: es el resultado gráfico de la electroforesis capilar. Se observan diferentes picos de colores, donde cada color corresponde a un nucleótido. El conjunto de estos picos ordenados corresponde a la secuencia de un fragmento de ADN.

Salida/Resultado

 

Es un archivo computacional que contiene un gráfico (cromatograma) de la secuencia de nucleótidos provenientes de un fragmento de ADN.
Fuentes de error más frecuentes

 

Errores en la purificación del ADN

Baja concentración de ADN

Alta concentración de sales

Diseño erróneo de iniciadores

Errores comunes en las técnicas de biología molecular 
Métodos alternativos

 

Secuenciación alelo-específica por bisulfito

Pirosecuenciación

Secuenciación masiva de alto rendimiento
Aplicaciones

 

Genotipificación

SNP

Filogenia

Ancestría
Temas relacionados

 

Secuenciación de alto rendimiento

PCR

Filogenética

Evolución molecular

Diagnóstico clínico

Referencias:

Sanger F, Coulson AR (1975). A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. Mayo 25;94(3):441–448 Rapley, R (2000). The Nucleic Acid Protocols Handbook. Totowa, Nueva Jersey, EUA: Humana Press.
Ver más


Cómo citar: Checa Rojas, A. (2017, 25 de Mayo ) Secuenciación convencional (Sanger). Conogasi, Conocimiento para la vida. Fecha de consulta: Octubre 22, 2018

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