Microarreglo de ADN

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Conocimientos previos Transcripción de ADN Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc Expresión génica Genotipo Fenotipo Transcriptoma Genoma Descripción Los…

Conocimientos previos

Transcripción de ADN
Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc
Expresión génica
Genotipo
Fenotipo
Transcriptoma
Genoma

Descripción

Los microarreglos son una herramienta de la biología molecular y las ciencias genómicas con diversas aplicaciones, que van desde medir o cuantificar la expresión génica  o mutaciones en genes específicos para el  diagnóstico  de enfermedades hasta GWAS. Además, son ampliamente usados para la obtención de información de transcriptomas y genomas. Los microarreglos se fundamentan en la hibridación o unión de secuencias de ADN de las muestras problema y control que se encuentran marcadas con marcadores  fluorescentes  (rojo y verde las más usadas); estas se unen a sus complementarios que están adheridos a una superficie sólida. Esta superficie, generalmente de vidrio, tiene impresas miles de secuencias nucleotídicas que se encuentran perfectamente ordenadas sobre la superficie formando varias  retículas. Al unirse (hibridar) las secuencias de las muestras (control/problema), la intensidad de fluorescencia emitida determinará la cantidad de secuencias que son complementarias y están presentes en la muestra que hibridó. De esta manera se puede  cuantificar la cantidad de genes que se expresan en una determinada condición fisiológica. En la investigación biomédica este método es usado para comparar los transcritos de enfermedades como el cáncer contra individuos sin la enfermedad, permitiendo conocer qué genes se expresan cuando hay un padecimiento de interés.

Entrada/Muestra

 

Muestras de  ADN o ADNc (sano vs. enfermo, control vs. problema)

Recursos/Material

 

 

    • Muestras problemas: son ácidos nucleicos provenientes de varias muestras biológicas representativas. Estas presentan características fenotípicas similares o están expuestas a las mismas condiciones que se desean estudiar (condiciones ambientales, enfermedades, etc). Dichas condiciones pueden variar dependiendo del diseño experimental, tipo de muestreo y/o los criterios del investigador (un ejemplo de muestras problema es el ARN total de células sanguíneas de pacientes con diabetes) 2 .

 

    • Muestras control o silvestres: ácidos nucleicos provenientes de diferentes muestras biológicas que no presentan las características fenotípicas de una muestra problema (por ejemplo, ARN total de células sanguíneas de individuos sin diabetes).

 

    • Reactivos de síntesis de ADNc: ver Método de aislamiento ARNm y síntesis de ADNc.

 

    • Espectrofotómetro: equipo que sirve para medir la concentración de sustancias.

 

    • Reactivos para el marcaje con cianinas: generalmente se usan CY3 y CY5. Cy3 es una molécula de color verde-amarillo fluorescente , mientras  que Cy5 es rojo fluorescente.

 

    • Horno de hibridación: equipo que sirve para calentar y permite la unión de las muestras con el microarreglo.

 

    • Centrífuga de evaporación: equipo que ayuda a la eficiente separación de disolventes mediante la evaporación con ayuda de una bomba de vacío; al mismo tiempo, la muestra se rota a altas velocidades por centrifugación, evitando que ésta sea succionada.

 

    • Microarreglo: material de vidrio (generalmente) que tiene impreso  de manera ordenada un conjunto de secuencias conocidas de nucleótidos en una pequeña superficie (en algunos casos, 10,000 secuencias por cm2). Estas secuencias se unirán a las muestras problema y control) en el mismo microarreglo.

 

    • Lector de Microarreglos: aparato especializado que permite escanear y analizar el microarreglo, detectando las moléculas marcadas con fluorescencia  y almacenándolas como una imagen.

 

 

 

Requisitos previos

 

Extracción de ADN o síntesis de ADNc

Procedimiento

Este método puede utilizar  ARNm  o  ADN  como se describe a continuación:

Método Extracción de ARN total: se obtiene el  ARN  total de las muestras para después poder separar el  ARNm .

1.1  Método de aislamiento ARNm y síntesis de ADNc: en este paso se aíslan los  ARNm de las muestras problemas y controles; a cada muestra se le agrega un nucleótido modificado (dUTP-Cy3 o dUTP-Cy5) para la síntesis de ADNc, lo que permite obtener las muestras con diferentes colores y poder diferenciarlas en los análisis.

Método de Extracción de ADN: se puede partir también de solo  ADN . Este material se aísla y purifica al igual que en el  ARN  de ambas muestras (control y problema).

2.1  Método de PCR: tras la extracción de  ADN , se realiza una PCR con iniciadores aleatorios. Esto permite la amplificación de todos los fragmentos del ADN pero en presencia de un nucleótido modificado (dUTP-Cy3, dUTP-Cy5) para obtener las muestras problemas y los controles con diferentes colores.

3. Hibridación del Microarreglo: una vez que se tiene marcado el ADNc o el  ADN  control y problema, se unen o hibridan ambos tipos de muestra en la misma placa de microarreglo. Esto se hace a una temperatura de 42-50°C y en un ambiente saturado de humedad para evitar evaporación.

4. Lectura del microarreglo: con la ayuda de un  láser se incide en la placa de microarreglo para observar las moléculas  fluorescentes unidas a cada secuencia del microarreglo. Se obtiene una imagen de cada una de las muestras marcadas CY3 y CY5 (control-problema), para posteriormente compararlas. Ej.: si en un experimento se marcó la muestra problema con rojo y el control con verde, se observarán tonalidades que van del rojo al verde. Si el punto que se esta observando es amarillo, la cantidad de rojo y verde es proporcional, pero si tiende más al rojo o al verde será porque hubo más secuencias de una muestra: es decir, si tiende al rojo, hubo más secuencias de la muestra problema;  si es verde, hubo más secuencias de la muestra control.

5. Cuantificación del microarreglo: para adquirir valores cuantitativos de las señales de fluorescencia del microarreglo es necesario analizar las imágenes con  softwares comerciales (ej.: http://linus.nci.nih.gov/BRB- ArrayTools.html).

Para analizar apropiadamente las imágenes obtenidas se pueden considerar los siguientes pasos: limpieza de  impurezas, definir las retículas del microarreglo y extraer la señal de fondo de la imagen. Una vez definidos estos parámetros, se calcula la densidad de los pixeles en cada área definida. Esto genera una tabla de datos con las coordenadas y los valores de densidad, fondo y señal para cada muestra del microarreglo. Esta información es complementada con la base de datos que contiene el nombre del  gen, su función y la vía metabólica a la que pertenece.

6. Interpretación de los resultados: después de generar la tabla de datos se requiere hacer el análisis e interpretación de los resultados. Para esto es necesario un análisis estadístico, el cual se puede realizar con software comercial o libre. Existen instituciones o empresas que producen software de análisis de datos para microarreglos, como:

http://www.statsci.org/micrarra/analysis.html.

Para más detalles, ver Método bioinformático: microarreglo de ADN

Salida/Resultado

 

Los resultados muestran una comparación de los cambios de expresión de genes entre una muestra control y un problema, asociados a un fenotipo de estudio.

Fuentes de error más frecuentes

 

Calidad de las muestras

Calidad del ARN total

Calidad del ADN

Diseño del estudio

Ruido de fondo de la imagen

Tamaño insuficiente del muestreo

Limitacione tecnológicas

Métodos alternativos

 

Secuenciación alelo-específica por bisulfito

Pirosecuenciación

Secuenciación masiva de alto rendimiento

 RNA-seq

Aplicaciones

Transcriptoma 

Expresión génica 

Esplaisosoma

SNP

Diagnóstico 

GWAS

Temas relacionados

 

Expresión génica 

Genómica

Transcriptómica 

 Fenotipo

Genotipo 

SNP

Diagnóstico molecular

Notas

 

NA

Referencias

Referencias:

Ramírez, J., Chávez, L., Santillán, J. Guzmán, S. (2003). microarreglos de DNA. 2016, de UNAM. Sitio web: http://bq.unam.mx/wikidep/uploads/MensajeBioquimico/Mensaje_Bioq03v27p097_Jorge_Ramirez.pdf Castillo, G. (2011). Muestreo de poblaciones: tipos de muestreo. 2016, de Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. España. Sitio web: http://recursostic.educacion.es/descartes/web/materiales_didacticos/muestreo_poblaciones_ccg/tipos_muestreo.htm
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Cómo citar: Checa Rojas, A. (2016, 22 de Junio ) Microarreglo de ADN. Conogasi, Conocimiento para la vida. Fecha de consulta: Septiembre 20, 2018

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