Microarreglo de ADN

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Conocimientos previos ADN Transcripción Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc Expresión génica Genotipo Fenotipo Transcriptoma Genoma  Descripción Los microarreglos…

Conocimientos previos

ADN
Transcripción
Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc
Expresión génica
Genotipo
Fenotipo
Transcriptoma
Genoma 
Descripción

 

Los microarreglos son una herramienta de la biología molecular y las ciencias genómicas con diversas aplicaciones, medir o cuantificar la  expresión génica  o  identificar mutaciones  en genes específicos para el diagnóstico de enfermedades entre otras aplicaciones.  Para el uso del microarreglo se utiliza ADNc o ADN  que se marcan con  diferentes colores, esto para poder diferenciarlas, ya que se analizaran al mismo tiempo. Dentro del microarreglo se unirán las secuencias de ADN de las dos muestras; a unas  secuencias de ADN complementarias  que se encuentran adheridas a una superficie sólida generalmente hechas de vidrio . Esta superficie, tiene impresas miles de secuencias que representan todos los genes de un genoma, o las mutaciones conocidas de genes, etc. y están perfectamente ordenadas en pequeños puntos formando  una red a escala milimétrica, donde cada punto contiene las secuencias de ADN que han de unirse. Cuando se unen o hibridan las secuencias de las muestras, la fluorescencia emitida determinará la cantidad de secuencias que son complementarias y están presentes  en la muestra que hibridó. Por ejemplo, tenemos una muestra control (muestra sin enfermedad) de color rojo y una muestra problema de color verde (muestra con enfermedad). Si se obtiene  una coloración totalmente roja quiere decir que esta secuencia se encuentra solo en el control y no en el problema, o bien si es solo de color verde quiere decir que solo se encuentra en el problema (enfermedad) y no en el control. Pero esto normalmente no es así y las tonalidades pueden variar y dar desde el naranja al amarillo-verde, el cual quiere decir que si da un color hacia los tonos anaranjados estará más en el control (rojo) y si es amarillo hacia el problema (verde).  Existen programas computacionales que facilitan el análisis de tonalidades de color obtenidas. En la investigación biomédica  los microarreglos son utilizados  para comparar los genes de enfermedades como  el cáncer  comparados con individuos  sanos.  A este proceso se le conoce como análisis de expresión génica.
Entrada/Muestra

 

Muestras de ADN o ADNc (sano vs. enfermo, control vs. problema)
Recursos/Material

 

 

 

    • Muestras problemas: ácidos nucleicos (ADN  o ARNm) provenientes de muestras biológicas. Estas presentan características similares o están expuestas a las mismas condiciones que se desean estudiar (edad, condiciones ambientales, enfermedades, etc). Dichas condiciones pueden variar dependiendo del diseño experimental, tipo de muestreo y/o los criterios del investigador (un ejemplo de muestras problema es el ARN total de células sanguíneas de pacientes con diabetes).

 

    • Muestras control o silvestres: ácidos nucleicos provenientes de diferentes muestras biológicas que no presentan las  características  de una muestra problema (por ejemplo, ARN total de células sanguíneas de individuos sin diabetes).

 

    • Reactivos de síntesis de ADNc: ver Método de aislamiento ARNm y síntesis de ADNc.

 

    • Espectrofotómetro: equipo que sirve para medir la concentración de sustancias.

 

    • Reactivos para el marcaje de nucleótidos  : generalmente se usan unos reactivos llamados CY3 y CY5. Cy3 es una molécula de color verde-amarillo fluorescente, mientras  que Cy5 es rojo fluorescente.

 

    • Horno de hibridación: equipo que sirve para calentar y permite la unión de las muestras con el microarreglo.

 

    • Centrífuga de evaporación: equipo que ayuda a la eficiente separación de disolventes mediante la evaporación con ayuda de una bomba de vacío; al mismo tiempo, la muestra se rota a altas velocidades por centrifugación, evitando que ésta sea succionada.

 

    • Microarreglo: material de vidrio (generalmente) que tiene impreso  de manera ordenada un conjunto de secuencias conocidas de nucleótidos en una pequeña superficie.

 

    • Lector de Microarreglos: aparato especializado que permite escanear y analizar el microarreglo, detectando las moléculas marcadas con fluorescencia  y almacenándolas como una imagen.

 

 

Requisitos previos

 

Extracción de ADN o ADNc
Procedimiento

 

Este método puede utilizar ARNm o ADN como se describe a continuación:

Método Extracción de ARN total: se obtiene el ARN total de las muestras para después poder separar el ARNm .

1.1  Método de aislamiento ARNm y síntesis de ADNc: en este paso se aíslan los ARNm de las muestras problemas y controles; a cada muestra se le agrega un nucleótido modificado de color (Verde-amarillo o rojo) para la síntesis de ADNc, lo que permite obtener las muestras con diferentes colores y poder diferenciarlas en los análisis.

2. Método de Extracción de ADN: se puede partir también de solo ADN. Este material se aísla y purifica al igual que en el ARN de ambas muestras (control y problema).

2.1  Método de PCR: tras la extracción de ADN, se realiza una PCR con iniciadores aleatorios. Esto permite la amplificación de todos los fragmentos del ADN pero en presencia de un nucleótido modificados (Cy3 y Cy5) para obtener las muestras problemas y los controles con diferentes colores.

3. Hibridación del Microarreglo: una vez que se tiene marcado el ADNc o el ADN de muestras control y problema, se unen o hibridan ambos tipos de muestra en la misma placa de microarreglo.

4. Lectura del microarreglo: con la ayuda de un láser que incide en la placa de microarreglo permite observar las moléculas fluorescentes unidas a cada secuencia del microarreglo. Posteriormente se obtiene una imagen de cada una de las muestras marcadas (control-problema), para posteriormente compararlas. Ej.: si en un experimento se marcó la muestra problema con rojo y el control con verde, se observarán tonalidades que van del rojo al verde. Si el punto que se observa es amarillo, la cantidad de rojo y verde es proporcional, pero si tiende más al rojo o al verde será porque hubo más secuencias de una muestra: si tiende al rojo, hubo más secuencias de la muestra problema;  si es verde, hubo más secuencias de la muestra control.

5. Cuantificación del microarreglo: para adquirir valores cuantitativos de las señales de fluorescencia del microarreglo es necesario analizar las imágenes con programas de computadora de uso comercial (ej.: http://linus.nci.nih.gov/BRB- ArrayTools.html).  Se genera una tabla de datos con las coordenadas y los valores de cada muestra del microarreglo. Esta información es complementada con la base de datos que contiene el nombre del gen y  su función.

6. Interpretación de los resultados: después de generar la tabla de datos se requiere hacer el análisis e interpretación de los resultados. Para esto existen instituciones o empresas que producen software de análisis de datos para microarreglos, como: http://www.statsci.org/micrarra/analysis.html. Para más detalles, ver Método bioinformático: microarreglo de ADN
Salida/Resultado

 

Comparación de los cambios de la expresión génica entre una muestra control y un problema, asociados a un fenotipo de estudio.
Fuentes de error más frecuentes

 

Calidad de las muestras

Calidad del ARN total

Calidad del ADN

Diseño del estudio

Ruido de fondo de la imagen

Tamaño insuficiente del muestreo

Limitación tecnológica
Métodos alternativos

 

PCR en tiempo real o QPCR

RNAseq 

Secuenciación de alto rendimiento 
Aplicaciones

 

 Transcriptoma 

Expresión génica 

Esplaisosoma

SNP

Diagnóstico 

GWAS
Temas relacionados

 

Expresión génica 

Genómica

Transcriptómica 

 Fenotipo

Genotipo 

SNP

Diagnóstico molecular

Referencias:

Ramírez, J., Chávez, L., Santillán, J. Guzmán, S. (2003). microarreglos de DNA. 2016, de UNAM. Sitio web: http://bq.unam.mx/wikidep/uploads/MensajeBioquimico/Mensaje_Bioq03v27p097_Jorge_Ramirez.pdf
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Cómo citar: Checa Rojas, A. (2017, 25 de Mayo ) Microarreglo de ADN. Conogasi, Conocimiento para la vida. Fecha de consulta: Agosto 19, 2018

Esta obra está disponible bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-No Comercial Compartir Igual 4.0

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