Método: Secretoma de líneas celulares

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Antelmann y colaboradores acuñaron el término de “secretoma”, y se define como un subgrupo del proteoma que activamente se secreta fuera de la célula, por lo cual, obtiene su nombre. El secretoma de las células y de los tejidos puede reflejar una amplia variedad de condiciones patológicas y representa una fuente muy rica para la búsqueda de biomarcadores. Las proteínas secretadas, se aísla generalmente de sobrenadantes de cultivos celulares o de fluidos corporales, haciendo difícil su identificación y análisis, porque estas proteínas se enmascaran a menudo con otras de altas concentraciones (Greenbaum, Luscombe, Jansen, Qian, & Gerstein, 2001; Zwickl et al., 2005).

Material y equipos

  1. Botellas de cultivo de ≥500 cm2
  2. Medio de cultivo con y sin Rojo Fenol
  3. Micropipetas y pipetas para cultivo
  4. Antibiotico-Antimicotico
  5. Incubadora con inyección de CO2
  6. Centrifugaas
  7. Membranas de PVDF 0.22 µm
  8. Liofilizador
  9. Congelador o Ultracongelador

Reactivos

  1. Nitrógeno líquido
  2. Acetona
  3. Disolución fisiológica
  4. Sacarosa
  5. Tris-Base
  6. KCl
  7. HCl
  8. EDTA
  9. 2-Mercaptoetanol
  10. PVPP
  11. Urea
  12. Tiourea
  13. CHAPS
  14. TBP
  15. Anfolinas
  16. DTT
  17. Acetato de amonio
  18. Metanol
  19. Bradford

Procedimiento

  1. Las líneas celulares se cultivan con  medio Advanced-RPMI 1640 suplementado con antibióticos (Anti-anti, Gibco) y sin suero fetal bovino (SFB) a una temperatura de 37°C, 5% de CO2 y un ambiente saturado de humedad.
  2. Para obtener los sobrenadantes, las células de cáncer se crecen hasta el 70% de confluencia en botellas de cultivo de 500 cm2
  3. Se lavan con abundantemente con disolución fisiológica (~800mL) y se incuban por 20h con medio fresco RPMI-1640 sin rojo fenol.
  4. El sobrenadante se colecta y se centrifuga a 4,500 g por 5 min y posteriormente se filtra con una membrana de PVDF (0.22 µm) para eliminar cualquier célula en suspensión.
  5. Las muestras se congelan en nitrógeno líquido y se liofilizan durante 48 horas o hasta que esten completamente deshidratadas.
  6. Posteriormente se resuspende la muestra en un volumen entre 1-10 mL y se precipitan las proteínas con acetona fría al 90% por ≥2h a -20°C
  7. Se centrifuga a 5,000 g por 20 min, el botón se resuspende en un vortex
  8. Se agregan 5mL de buffer de extracción (ver abajo: Tabla 1)
  9. Se agrega un volumen igual de fenol para separar las proteínas y se agita durante 20 min
  10. Se centrifuga a 7,000 g por 10 min, y se recupera la parte orgánica
  11. Posteriormente se precipita con 5 volúmenes de acetato de amonio 0.1M en metanol por ≥2h a -80°C.
  12. Después se centrifuga y se obtiene un botón que será lavado 2-3 veces con 2 mL de acetona fría al 90% y un lavado con 500µL acetona fría absoluta.
  13. Se evapora la acetona con una centrifuga de vacio sin llevar sequedad la muestra
  14. Se agregan entre 50-100 µL de buffer de solubulización (ver abajo: Tabla 2). NOTA: se puede emplear buffer Leammli para ensayos de 1D o este buffer para 2D-PAGE 
  15. Y se procede a determinar la concentración proteica mediante el método de Bradford.

    Tabla 1. Buffer de extracción

    Concentración Final Reactivo para 200mL
    0.7 M Sacarosa 47.922 g
    0.5 M Tris-Base 12.11 g
    0.1 M KCl 1.4 g
    30 mM HCl 0.48 mL
    50 mM EDTA (292.24 g/mol) 2.9224 g
    2% v/v 2-Mercaptoetanol 4 mL
    1.2% p/v PVPP  2.4 g

    Tabla 2. Buffer de solubilización de proteínas

    Concentración Final Reactivo Para 5ml
    7 M Urea 2.1033 g
    2 M Tiourea 0.761 g
    4% CHAPS 0.2 g
    2 mM TBP 0.05 mL
    2% Anfolinas 3-10pH 0.1 mL
    60 mM DTT 0.04627 g

Referencias:

Greenbaum, D., Luscombe, N. M., Jansen, R., Qian, J., & Gerstein, M. (2001). Interrelating different types of genomic data, from proteome to secretome: ’Oming in on function. Genome Research, 11(9), 1463–1468. http://doi.org/10.1101/gr.207401 Zwickl, H., Traxler, E., Staettner, S., Parzefall, W., Grasl-Kraupp, B., Karner, J., … Gerner, C. (2005). A novel technique to specifically analyze the secretome of cells and tissues. Electrophoresis, 26(14), 2779–2785. http://doi.org/10.1002/elps.200410387

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