Introducción
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica sensible y muy útil para obtener y generar muchas copias de secuencias específicas de ADN de una muestra compleja de ADN con una diversidad y abundancia diferencial de secuencias; a este proceso se le conoce como: amplificación del ADN. Para llevar a cabo este proceso, se requiere de la utilización de una enzima llamada Taq Polimerasa que es ampliamente utilizada en estos métodos y sus variantes. Este método proporciona recomendaciones para garantizar una PCR exitosa.
Material
- Micropipetas
- Puntas para PCR
- Autoclave
- Tubos para PCR
- Gradilla para tubos de PCR
- Termociclador
Reactivos
- Buffer de Reacción Taq 10X
- dNTPs
- Primers
- ADN estándar
- Agua libre de Nucleasas
- Taq Polimerasa
Procedimiento
NOTA: Antes de comensar es recomendable preparar la reacción sobre hielo y precalentar el termociclador a 95 ° C. Todos los materiales deben estar esteriles (autoclave) y limpios.
- Prepare los tubos que habrá de utilizar para su PCR en una gradilla. NOTA: Preferentemente NO etiquete la tapa del tubo ya que se puede borrar, mejora etiquete en los costados
- Realice los cálculos de para preparar las reacciones necesarias
- Coloque en cada tubo los primers que ha de usar como el de la secuencia problema y control de carga ej.: B-actina, GAPDH, betaína, etc.
- Agregue cada componente de la tabla 1 en orden descendente en un tubo y marque el tubo como MasterMix. NOTA: coloque la polimerasa al final. Saque del congelador la enzima y regresela inmediatamente después.
- Coloque una cantidad proporcional en cada tubo y pongola en el termociclador (figura 1) ya programado con las condiciones de la PCR (ver tablas abajo).
- Al terminar su PCR analice su producto en un gel de agarosa.
Tabla 1. Reactivos para la PCR
| Reactivos | 25 μL para 1rx | 50 μL para 1rx | Concentration Final |
| Buffer de Reacción Taq 10X | 2.5 μL | 5 μL | 1X |
| dNTPs 10 mM | 0.5 µL | 1 μL | 200 µM |
| Primer 3′ 10 µM | 0.5 µL | 1 μL | 0.2 µM (0.05–1 µM) |
| Primer 5′ 10 µM | 0.5 µL | 1 μL | 0.2 µM (0.05–1 µM) |
| ADN molde | variable (entre 2-10 µL) | variable | <1,000 ng |
| Agua libre de Nucleasas | lleve a 25 µL | lleve a 50 µL | |
| Taq Polimerasa | 0.125 µL | 0.25 µL | dependiendo del proveedor |
NOTA: La amplificación de ADN molde estructura secundaria alta, alto contenido de GC, bajas concentraciones o con más de 5 kb puede requerir una mayor optimización.
Condiciones del Termociclador para una PCR convencional
| Pasos |
Temperatura |
Tiempo |
| Desnaturalización | 95°C | 1 minuto |
| 25-30 Ciclos | 95°C 45-68°C 68-72°C |
15-30 segundos 15-60 segundos 1 minute/Kb |
| Extensión Final | 68-72°C | 5 minutos |
| Mantener a | 4-10°C | ∞ |
PCR de dos pasos: 2-step PCR
Cuando los primers tienen una temperatura de alineamiento superior a 65°C se debe realizar una PCR de dos pasos.
Condiciones de la PCR para un protocolo de PCR de 2 pasos:
| Paso | Temperatura |
Tiempo |
| Desnaturalización Inicial | 95°C | 30 segundos |
| 25-30 Ciclos | 95°C 65-68°C |
15-30 segundos 1 minutos/Kb |
| Extensión Final | 65-68°C | 5 minutos |
| Temperatura Final Mantener a | 4-10°C | ∞ |
Resultado
Cómo citar: Checa Rojas, A. (2017, 14 de Noviembre ) Método: PCR. Conogasi, Conocimiento para la vida. Fecha de consulta: Diciembre 5, 2020
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2 Comentarios en "Método: PCR"
¿Necesitan sacar la sangre para la prueba de pcr?
Hola Daniel, la prueba de PCR es un método para la amplificación de ADN, y puedes usar diversas muestras biológicas que contengan células y dentro de estas (ADN). Entre las muestras biologicas que puedes usar son: saliva (células epiteliales de la boca), Orina (células epiteliales del tracto genitourinario), sangre (células blancas del sistema inmune), tejido (piel, biopsias, etc.), organos (pulmón, corzón, cerebro, etc. de organismos pequeños como un ratón).