Método: PCR

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Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica sensible y muy útil para obtener y generar muchas copias de secuencias específicas de ADN de una muestra compleja de ADN (con una diversidad y abundancia diferencial de secuencias); a este proceso se le conoce como: amplificación del ADN.  Para llevar a cabo este proceso, se requiere de la utilización de una enzima llamada Taq Polimerasa de ADN, que es ampliamente utilizada en estos métodos y sus variantes. En este método se proporcionan recomendaciones para garantizar una PCR exitosa y recomendaciones para el diseño rápido de “primers” o iniciadores.

Material

  1. Micropipetas
  2. Puntas para PCR
  3. Autoclave
  4. Tubos para PCR
  5. Gradilla para tubos de PCR
  6. Termociclador

Reactivos

  1. Buffer de Reacción Taq 10X
  2. dNTPs
  3. Primers
  4. ADN estándar
  5. Agua libre de Nucleasas
  6. Taq Polimerasa

Procedimiento

NOTA: Antes de comensar es recomendable preparar la reacción sobre hielo y precalentar el termociclador a 95 ° C. Todos los materiales deben estar esteriles (autoclave) y limpios. 

 

  1. Prepare los tubos que habra de utilizar para su PCR en una gradilla. NOTA: Preferentemente NO etiquete la tapa del tubo, si no los costados
  2. Realice los cálculos de para prearar las reacciones necesarias
  3. Coloque en cada tubo los primers que ha de usar como el de la secuencia problema y control de carga ej.: B-actina, GAPDH, betaina, etc.
  4. Agregue cada componente de la tabla 1 en orden descendente en un tubo y marquelo como MasterMix. NOTA: coloque la polimeraza al final y saquela del congelador -20°C y regresela inmediatamente después de utilizarla 
  5. Coloque una cantidad proporcional en cada tubo y pongola en el termociclador ya programado
  6. Al terminar su PCR analice su producto en un gel de agarosa 

Tabla 1. Reactivos para la PCR

Reactivos  25 μL para 1rx 50 μL para 1rx Concentration Final
 Buffer de Reacción Taq 10X 2.5 μL 5 μL 1X
dNTPs 10 mM 0.5 µL 1 μL 200 µM
Primer 3′ 10 µM 0.5 µL 1 μL 0.2 µM (0.05–1 µM)
Primer 5′ 10 µM 0.5 µL 1 μL 0.2 µM (0.05–1 µM)
ADN molde variable (entre 2-10 µL) variable <1,000 ng
Agua libre de Nucleasas lleve a 25 µL lleve a  50 µL
Taq Polimerasa 0.125 µL 0.25 µL dependiendo del proveedor

 

NOTA: La amplificación de ADN molde estructura secundaria alta, alto contenido de GC, bajas concentraciones o con más de 5 kb puede requerir una mayor optimización.

Condiciones del Termociclador para una PCR convencional

Pasos
Temperatura
Tiempo
Desnaturalización 95°C 1 minuto
25-30 Ciclos 95°C
45-68°C
68-72°C
15-30 segundos
15-60 segundos
1 minute/Kb
Extensión Final 68-72°C 5 minutos
Mantener a 4-10°C   ∞

PCR de dos pasos: 2-step PCR

Cuando los primers tienen una temperatura de alineamiento superior a 65°C se debe realizar una PCR de dos pasos.

Condiciones de la PCR para un protocolo de PCR de 2 pasos: 

Paso Temperatura
Tiempo
Desnaturalización Inicial 95°C 30 segundos
25-30 Ciclos 95°C
65-68°C
15-30 segundos
1 minutos/Kb
Extensión Final 65-68°C 5 minutos
Temperatura Final Mantener a 4-10°C  ∞

 

Referencias:

Sambrook, J., Russel, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Hengen PN. Optimizing multiplex and LA-PCR with betaine. Trends Biochem Sci. 1997 Jun;22(6):225–226 Sun, Y., Hegamyer, G. and Colburn, N. (1993). PCR-direct sequencing of a GC-rich region by inclusion of 10% DMSO: application to mouse c-jun.Biotechniques. 15, 372-374. Sarkar, G., Kapelner, S. and Sommer, S.S. (1990). Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucleic Acids Res.. 18, 7465.

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