Extracción fenólica de proteínas

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Descripción La extracción de proteínas con fenol es un método alternativo a la extracción clásica de TCA-acetona. Permite la recuperación eficiente…

Descripción

La extracción de proteínas con fenol es un método alternativo a la extracción clásica de TCA-acetona. Permite la recuperación eficiente de proteínas y elimina los componentes no proteicos, polisacáridos, lípidos y compuestos fenólicos. Después de la extracción con fenol, las proteínas se precipitan con acetato de amonio en metanol. Esta extracción ha sido probado para electroforesis de una y dos dimensiones (1-DE y 2-DE) con mucha eficiencia.

Material

  • Material biologico
  • Mortero de cerámica o vidrio
  • Guantes de nitrilo o latex
  • Micropipetas
  • Puntas para micropipetas
  • Tubos de 1.5 mL
  • Centrífuga
  • Sonicador
  • Recipiente de plástico para hielo

Reactivos

  • Nitrógeno líquido
  • Inhibidores de proteasas y fosfatasas
  • Acetona
  • Sacarosa
  • Tris-Base
  • KCl
  • HCl
  • EDTA
  • 2-Mercaptoetanol
  • PVPP
  • Urea
  • Tiourea
  • CHAPS
  • TBP
  • Anfolitos
  • DTT
  • Acetato de amonio
  • Metanol

Procedimiento

NOTA: este procedimiento se ha realizado en tejidos de mamífero y plantas, células en cultivo (mamífero, hongos y bacterias).

  1. Cuando se utiliza tejido es necesario congelarlo (-80 °C) y después macerarlo en nitrógeno líquido sobre un mortero de cerámica o vidrio.  En caso de usar células en cultivo pasar al paso 3.
  2. Se macera el tejido en un mortero evitando que se descongele y se vea pastoso el tejido. Se presiona la muestra con el pistilo hasta que se observe un polvo muy fino (ir al paso 4).
  3. Retirar el medio por centrifugación a 2,000 x g durante 4 minutos para células de mamíferos y 5,000 x g para bacterias y hongos. Una vez obtenido el botón celular o el polvo de tejido macerado se transfiera a un tubo 1.5 mL con 1 mL de una disolución acuosa con inhibidores de proteasas y fosfatasas.
  4. Se coloca la muestra en un sonicador y se dan 3 pulsos de 1-5 segundos dejando reposar la muestra en intervalos de 10 segundos sobre hielo.
  5. Después, se agregan 5 volúmenes de acetona al 99.99% y se deja 1-2 horas a menos 20 grados Celsius (-20°C).
  6. Posteriormente se centrifuga a 5,000 x g durante 10 min y se retira el sobrenadante, dejando evaporar la acetona del botón.
  7. Se agrega 500 µL de buffer de extracción (ver tabla 1) y 600 µL de fenol sobre el botón, se le da vortex durante 10 min.
  8. Se centrifuga a 4,000 x g por 10 min y se recupera la parte acuosa (superior).
  9. Se agregan 3 volúmenes de acetato de amonio 0.1 M diluido en metanol y se deja precipitando ≥1 h a menos 70 grados Celsius (-70°C).
  10. Se centrifuga a 4,000 x g por 20 min y se lava 3 veces con acetato de amonio-metanol. El último lavado se realiza con acetona al 99.9%
  11. Se evapora la acetona en una centrífuga de vacío (speed vac) o se deja evaporar boca abajo. NOTA: no lleve a sequedad total.
  12. Se solubiliza el botón con el buffer de solubilización (ver tabla 2) con 50-500 µL dependiendo del tamaño de la muestra. Este buffer de solubilización es compatible para geles 2D-PAGE (para más detalles consultar el método de Geles de 2D-PAGE)
  13. Centrifugar a 13,000 x g por 20 min para retirar el material insoluble, deposite el sobrenadante en un tubo nuevo y cuantifique la muestra (ver método de cuantificación Bradford).

Tabla 1. Buffer de extracción

Concentración Final Reactivo para 200 mL
0.7 M Sacarosa 47.922 g
0.5 M Tris-Base 12.11 g
0.1 M KCl 1.4 g
30 mM HCl 0.48 mL
50 mM EDTA (292.24 g/mol) 2.9224 g
2% v/v 2-Mercaptoetanol 4 mL
1.2% p/v PVPP  2.4 g

Tabla 2. Buffer de solubilización de proteínas

Concentración Final Reactivo Para 5 mL
7 M Urea 2.1033 g
2 M Tiourea 0.761 g
4% CHAPS 0.2 g
2 mM TBP 0.05 mL
2% Anfolitos 3-10 pH* 0.1 mL
60 mM DTT 0.04627 g

*NOTA: el rango de pH de las anfolitos se usarán dependiendo de las necesidades del experimento.

Referencias:

Chrambach A. (1985). The practice of quantitative gel electrophoresis. VCH Deerfield Beach. Shi Q and Jackoski G. (1998). One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Hames BD ed. Gel Electrophoresis of proteins: A practical Approach. 3rd Oxford University Press. Sambrook, J., Russel, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
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Cómo citar: Checa Rojas, A. (2018, 21 de Marzo ) Extracción fenólica de proteínas. Conogasi, Conocimiento para la vida. Fecha de consulta: Septiembre 20, 2021

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1 Comentario en "Extracción fenólica de proteínas"

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wilfredo

una pregunta especifica y es ¿puedo utilizar este procedimiento para polen de arboles?

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