Genotipificación por secuenciación Sanger

Conocimientos previos

Descripción

La genotipificación por secuenciación Sanger es el método usado para determinar las variaciones específicas que existen en un fragmento de ADN . Estas variaciones se analizan mediante el método de secuenciación convencional tipo Sanger de manera individual, es decir, analizando gen (gene) por gen. En la investigación biomédica estas técnicas sirven para identificar tipos virales y  SNPs de genes específicos asociados a enfermedades 1, 2.

Entrada/Muestra

Secuencia de métodos

1. Método de Extracción de ADN (Extracción de ADN.  Nivel básico) o Método de Extracción de ARN total (Extracción de ARN total: Nivel Básico): por medio de este método se obtienen los ácidos nucleicos a partir de  células que pueden provenir de un cepillado bucal, saliva, sangre o cualquier tejido.  Para cualquiera de los dos métodos es necesario analizar la calidad de la extracción realizando un gel de electroforesis ( ver punto 2). Si se desea extraer  ARN total es necesario separar el  ARNm (ver punto 1.1)

1.1  Método de Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc (Aislamiento de ARNm y síntesis de ADNc, Nivel Básico): En este método se separa el ARN mensajero (ARNm) a partir de una muestra de ARN total y posteriormente se analiza con una electroforesis (ver punto 2).

2.  Método Electroforesis en gel ( Electroforesis (gel de agarosa y poliacrilamida) Nivel básico ): este método se utiliza para separar fragmentos de ADN o ARN;  dicha separación permite  conocer la calidad de nuestras muestras.

3. Método de PCR (PCR Nivel: básico): este método permite obtener un gran número de copias de ADN a partir de un ADN molde; multiplicar la cantidad de ADN es necesario para la secuenciación.

4. Método de electroforesis gel de agarosa ( Electroforesis (gel de agarosa y poliacrilamida) Nivel básico ): método que se utiliza para separar fragmentos de ADN provenientes de la PCR. Este paso es necesario para eliminar componentes no deseados, esto se hace solo recortando la banda deseada y posteriormente se purifica.

5. Purificación de banda: en este paso se recorta una sección del gel que contiene nuestro fragmento de ADN y se procede a su purificación. Es recomendable cargar dos muestras en el mismo gel, una marcada con un colorante y otra no (que es la que será recortada). Por lo general se utilizan métodos comerciales para su purificación, de empresas como Qiagen, Promega, Biotools, Invitrogen, etc.

6. Método de Cuantificación del ADN: después de la purificación del ADN es necesaria su cuantificación. Para esto se utiliza un aparato llamado espectrofotómetro, el cual mide la concentración en una muestra.

7. Método Secuenciación convencional Sanger ( Secuenciación convencional (Sanger). Nivel básico ): con este método se conoce la secuencia de los nucleótidos del ADN.

8. Análisis de la secuencia y sus variaciones (Bioinformática): este paso se puede hacer de manera manual en el caso tener pocas muestras o empleando herramientas bioinformáticas cuando se utilizan varias secuencias. El uso de herramientas bioinformáticas también es útil para para la visualización de la secuencia del gen,  alineamientos múltiples de las secuencias, BLAST, árboles filogenéticos y análisis de variaciones (para más detalles ver métodos bioinformáticos).

Salida/Resultado
Secuencia de un gen o fragmento de ADN o ADNc con los análisis de sus variaciones.

Procesos alternativos

Genotipifiación por microarreglo

Genotipificación por secuenciación de alto rendimiento

Aplicaciones

Filogenia

SNPs

Ancestria

Farmacogenómica

Diagnostico clínico

Temas relacionados

Filogenética

Detección de variantes

Genotipificación de ADNmt