Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Conocimientos previos

ADN
Extracción de ADN
Replicación del ADN

Descripción

La PCR, o reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en inglés), es un método que permite obtener un gran número de copias de ADN ^[1]a partir de un ADN molde ^[2]. Este método usa una proteína ^[3]llamada polimerasa ^[4], que está encargada de replicar es decir: hacer múltiples copias del ADN, evento que ocurre normalmente en la división celular ^[5]. La PCR es un método ampliamente usado en las áreas biológicas y de la salud porque es necesario utilizar una gran cantidad de ADN para su estudio y análisis. En estudios biomédicos se usa para el diagnóstico de enfermedades.

 

Materiales

• ADN molde: fragmentos de  ADN  donde se obtendrá la parte de la que se desea generar muchas copias.
• Iniciadores o “primers”: son dos secuencias cortas de ADN que se unen al ADN molde. Están constituidos por 20 nucleótidos o más y su función es dar inicio a la reacción de PCR.
• dNTPs: son nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de ADN.
• Polimerasa: es una proteína sirve para duplicar el ADN molde.
• Iones: son elementos químicos cargados positivamente necesarios para la función de la polimerasa.
• Termociclador: aparato que automatiza la PCR.

Procedimiento

1. Mezcla maestra: es la mezcla de todos los componentes para llevar a cabo la PCR colocados dentro de un recipiente y con un volumen muy pequeño (ADN molde, iniciadores, dNTPs, iones y polimerasa); para después ser colocados en el termociclador.
2. Desnaturalización del ADN: se calienta la mezcla maestra a 95°C por 5 minutos (aprox.) para separar el ADN que es de doble cadena.
3. Alineación: se baja la temperatura alrededor de 55-65°C para que se unan los iniciadores al ADN molde.
4. Extensión: se eleva la temperatura a 72°C y la polimerasa comienza a duplicar el ADN molde.
5. Ciclo de PCR: terminando la extensión se repite todo el proceso (30-35 veces).
6. Cuantificación: proceso por el cual se mide la concentración del ADN de la PCR mediante un equipo llamado espectrofotómetro.
   

   Resultado

   Múltiples copias de ADN provenientes de un fragmento ADN deseado.

Fuentes de error más frecuentes

Calidad del ADN

Baja concentración de ADN

Alta concentración de sales

Diseño erróneo de iniciadores o “primers”

Errores comunes en las técnicas de biología molecular

 

Aplicaciones

Técnicas biotecnológicas

Secuenciación

Filogenia

Ancestría

Genotipificación

Ciencias Forenses

Temas relacionados

Electroforesis ^[6]

Secuenciación

Diagnóstico molecular

Farmacogenómica ^[7]

Notas

Todos los materiales que se usan para la PCR deberán estar químicamente limpios y estériles, con el fin de evitar la degradación del ADN. Las copias de ADN son observadas mediante un gel de electroforesis. ^[6]