Secuenciación de alto rendimiento (Pirosecuenciación e Illumina)

Conocimientos previos

• Secuenciación convencional (Sanger)
• Genoma
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Descripción

La secuenciación de alto rendimiento, también llamada “de nueva generación” o secuenciación masiva, es un método usado para secuenciar de miles a millones de fragmentos de   ADN  diferentes al mismo tiempo. Estos fragmentos son adheridos a una superficie que puede ser nanoesferas o placas, con la finalidad de facilitar su manipulación y análisis.

Al igual que en la secuenciación convencional, es necesario utilizar una proteína llamada polimerasa y nucleótidos. En la secuenciación de alto rendimiento por placas se utilizan nucleótidos marcados que son agregados al ADN adherido a una placa. Un dispositivo va tomando fotografías de la placa de todos los nucleótidos incorporados en las múltiples secuencias. En el caso de las nanoesferas, la secuenciación se lleva a cabo mediante dos reacciones: primero se incorporan los nucleótidos uno por uno (A, T, C, G). Éstos reaccionan con una proteína y emiten una luz fluorescente indicando el nucleótido que se ha incorporado en el ADN molde. Posteriormente, esta luz es detectada y almacenada en un archivo de computadora, determinándose así la secuencia de nucleótidos de múltiples fragmentos de ADN.

La secuenciación de alto rendimiento permite una amplia gama de aplicaciones, lo que facilita a la investigación biomédica estudiar cualquier cuestión con relación al genoma de un organismo. Estos análisis dan indicios de procesos patológicos, ancestría,   diversidad genética, entre otros aspectos biológicos de interés.

Entrada/Muestra

Muestra biológica: ADN de una célula, tejido u órgano

Recursos/Material

• Adaptadores: secuencias conocidas de nucleótidos que se unen en los extremos de los fragmentos de ADN y se encuentran adheridos a una superficie sólida: nanoesferas o placas
• Soluciones amortiguadoras: Solución acuosa que contiene una mezcla patentada (patente) de sus componentes, incluyendo polimerasa, ligasa y dNTPs
• Placas: material de material sólido que provee el fabricante para generar copias de ADN que se requiere secuenciar
• Nanoesferas: estructuras esféricas de 20µm que contienen dos enzimas que servirán para detectar la secuencia de nucleótidos de nuestro ADN
• Aparato de secuenciación o secuenciador: equipo que permite llevar a cabo las reacciones de secuenciación

Requisitos previos

Extracción de ADN o extracción de ARN

Procedimiento

• Fragmentación el ADN: el ADN se fragmenta en 300-800 pares de bases (pb) para las nanoesferas y 75-200 pb para el uso de placas
• Preparación de la muestra: dos pares de adaptadores son agregados en cada extremo de todos los fragmentos de ADN
• Adhesión a la superficie: todos los fragmentos de ADN (de una sola cadena) son adheridos a una superficie (nanoesferas o placa)
• Amplificación clonal in vitro – PCR: esta reacción en cadena permite tener múltiples copias de un mismo fragmento de ADN que se encuentra adherido a una superficie. Al terminar la reacción se obtienen múltiples copias de todos los fragmentos de ADN (~2 millones de copias)
• Secuenciación por pirosecuenciación (Nanoesferas): en el caso de las nanoesferas, estas llevan a cabo dos reacciones químicas al añadir cada nucelótido (dNTP: A, T, C, G). La primera reacción es la unión de un dNTP con su nucleótido correspondiente a la cadena del ADN molde; esta unión libera una molécula llamada pirofosfato (PPi) que reacciona con otra enzima llamada sulfurilasa que convierte la PPi en ATP, el cual reacciona con otra enzima llamada luciferasa y emite una luz fluorescente que es detectada por una cámara. De acuerdo a lo que la cámara detecte, se almacenará esta información en archivos computacionales para su posterior análisis
• Secuenciación por síntesis (placas): se adicionan nucleótidos marcados con fluorescencia y cuando existe un apareamiento entre el ADN molde y el nucleótido marcado se le toma una imagen. El proceso se repite para cada nucleótido hasta obtener la secuencia de los fragmentos (35-1000 pares de bases)

Salida/Resultado

Archivos de texto con millones de secuencias de fragmentos de ADN de una muestra biológica. Estos resultados posteriormente pueden ser usados para ensamblar las secuencias utilizando herramientas bioinformáticas (ver Ensamble de genoma).

Fuentes de error más frecuentes

• Calidad del ADN
• Baja concentración de ADN
• Alta concentración de sales
• Incremento de error para lecturas muy grandes
• Alto ruido de trasfondo por el uso de fluorescencia

Métodos alternativos

• Secuenciación de nueva generación (Iontorrent)
• Secuenciación de nueva generación (Nanoporo o secuenciador de USB)

Aplicaciones

• Estudio de asociación del genoma completo (GWAS)
• Genotipificación
• Genómica Funcional
• Farmacogenómica
• Filogenia
• Ancestría
• Metagenómica

Temas relacionados

• Secuenciación de nueva generación (Iontorrent)
• Secuenciación Epigenoma: Bisulfite-seq
• Secuenciación Transcriptoma: RNA-seq
• Diagnóstico molecular
• Farmacogenómica