Conceptos Básicos de la Nano y Bionanotecnología 

Presentación Introductora a los Conceptos Básicos de la Nanotecnología y Bionanotecnología. 

[Diapositivas incluídas para una mejor comprensión aquí: Nanobiotecnología]

Nanotecnología

Etimológicamente, la palabra “nanotecnología” viene del griego nanos que significa enano y que es un prefijo que usamos para describir la billonésima parte de una unidad de medida y de techne que significa arte, técnica u oficio y de logos que es el estudio de algo. Entonces, podemos definir a la nanotecnología como la ciencia encargada de estudiar el control, fabricación y manipulación de materiales con dimensiones de 1 a 100 nanómetros en alguna de sus dimensiones.

El concepto fue introducido en 1959 por Richard Feynman durante su famoso seminario titulado “Hay mucho espacio ahí abajo”, donde introdujo la idea de la miniaturización, es decir de la construcción y control de maquinaria y materiales en escalas muy pequeñas. Sin embargo, no sería hasta el desarrollo de nuevos tecnologías de microscopía y manipulación atómica y molecular, que la nanotecnología adquiriría una mayor relevancia. Por ejemplo, el desarrollo de la microscopía electrónica o del descubrimiento de importantes estructuras de carbono como el fulereno en 1985 o los tubos de carbono a principios de los noventa, hicieron que la nanotecnología despegara a partir de las últimas décadas del siglo pasado. En años recientes, el número de revistas científicas dedicadas a nanotecnología rebasa el centenar y tan sólo en 2013 se publicaron más de 80 mil artículos especializados en ella. Este número es mucho más alto estos años. En el ámbito económico, se estima que para el 2020 se inviertan 75 billones de dólares en investigación y desarrollo de nanotecnologías, eso es más de diez veces la deuda externa de México. Y finalmente se registraron más de 12 mil patentes hace diez años. Esta última cifra puede que no se haya elevado mucho debido a nuevos y más rigurosos estudios en nanotoxicología.

Es difícil imaginarse a qué nos referimos cuando decimos que la nanoescala va de 1 a 100 nm. Los principales ejemplos de moléculas y estructuras de interés dentro de este rango que incluyen estructuras moleculares, ADN, liposomas, cadenas de polímeros, partículas metálicas, estructuras de carbono y virus. También están ilustrados otros objetos para comparación y referencia. En esta escala es claro que lo nano es más pequeño que una bacteria, pero más grande que átomos y moléculas sencillas.

Este crecimiento tan importante de la nanotecnología se debe a la gran variedad de aplicaciones que ésta puede tener. Entre ellas, se encuentran las aplicaciones biológicas y médicas, en desarrollo ambiental y agrícola la nanotecnología con la generación de nuevos pesticidas. Por otro lado, también tiene aplicaciones en la industria electrónica con el desarrollo de chips y las computadoras cuánticas, así como en la industria energética con del desarrollo de páneles solares, por ejemplo. Y finalmente, en la industria y transporte interviene en el desarrollo de nuevos materiales con novedosas propiedades.

Las ventajas que tiene el uso de nanomateriales en distintas áreas tecnológicas incluyen una mayor reactividad, nuevas propiedades químicas y físicas debido a su pequeño tamaño y sus prometedores aplicaciones en una amplia variedad de campos. Sin embargo, esto también conlleva desventajas. Las más importantes por supuesto son las concernientes a los impactos en la salud de los humanos y animales, pero también los impactos ambientales. Finalmente, el uso de estas tecnologías con fines terroristas o bélicos también representa una preocupación.

Bionanotecnología

Ya que definimos nanotecnología, vayamos al terreno que nos interesa que es la nanobiotecnología. Esta sub-rama es la conjunción de las ciencias biológicas, ingeniería y nanotecnología, donde, por un lado, la biotecnología provee de inspiración y herramientas para fabricar sistemas en la nanoescala, mientras la nanotecnología proporciona herramientas para mejorar a la primera. Esto con el fin de diseñar una nueva clase de dispositivos y/o sistemas multifuncionales con mejores sensibilidades, eficacia y especificidad.

Características de los nanomateriales

¿Qué características poseen los nanomateriales? La más evidente son las dimensiones. El estudio de estos materiales resulta importante en la biotecnología porque moléculas con particular relevancia como el ADN, las proteínas y los virus se encuentran en la nanoescala. Luego entonces, los nanodispositivos pueden interactuar directamente con ellas con fines de monitoreo, por ejemplo, detección de patógenos, entrega de fármacos, entre otros.

Hemos hablado también de la alta reactividad que presentan los materiales con nano dimensiones, y esto es debido a dos razones. La primera es que presentan una mayor área superficial por volumen. Por ejemplo, en tres diferentes dimensiones, si calculamos el área superficial de cada una de ellas, encontraríamos que éste se incrementa con el tamaño. Sucede lo mismo que con el volumen. Entonces, cuando realizamos el cociente o encontramos la proporción entre área superficial y volumen, vemos que entre más pequeña es la partícula, mayor es esta relación y entonces, en volúmenes más pequeños, tenemos una mayor área. Por otro lado, el que las partículas sean más pequeñas, tiene como consecuencia que haya una mayor cantidad de ellas podrá ocupar un determinado espacio. Por ejemplo en un estudio realizado para determinar la calidad del aire, Oberdörster y colaboradores muestran cómo en entre más pequeña es la partícula, mayor es su abundancia en un volumen fijo.

Sus pequeñas dimensiones también afectan su velocidad, de acuerdo la ecuación para determinar el coeficiente de difusión, donde la dependencia con el tamaño es inversamente proporcional: es decir, en un medio en definido, una partícula pequeña se moverá más rápido que una grande. Esto resulta relevante porque las nanopartículas presentan movimiento Browniano similar a las moléculas y átomos, y así podemos estudiar fenómenos moleculares y atómicos con mayor facilidad.

Una de las características más sobresalientes de las nanopartículas es que presentan propiedades químicas y físicas diferentes a su contraparte micro y macroscópica. En particular se han explotado sus características como nuevos y más eficientes catalizadores y como nanosensores, pero también por sus nuevas propiedades electrónicas, magnéticas, elásticas, de resistencia e hidrofobicidad que han permitido, por ejemplo, el desarrollo de nuevos materiales de construcción más ligeros y fuertes, o nuevas cubiertas más  funcionales, resistentes y duraderas. Quizá el ejemplo más común de esto son los quantum dots, que son nanopartículas compuestas generalmente de compuestos binarios como el selenurio de cadmio o fosfuro de indio, que presentan diferentes propiedades semiconductoras o de fluorescencia, de acuerdo a su tamaño y forma. Pequeños cambios en alguna de estas propiedades son suficientes para generar una gran gama de diferencias.

Las nanopartículas son también relativamente fáciles de manipular. Pueden ser sintetizadas y obtenidas en una amplia variedad de formas con diferentes materiales que les confieren distintas propiedades como magnéticas, electrónicas o fluorescentes, por ejemplo. Además pueden ser controladas por campos eléctricos o magnéticos. Por ejemplo, esta característica las hace muy útiles para aplicaciones en diagnóstico. Además, pueden ser funcionalizadas para que interaccionen de manera específica con células por ejemplo, para el tratamiento de cáncer o eliminación de patógenos. Y finalmente, también pueden ser manipuladas mecánicamente y en tiempo real con trampas ópticas o microscopios como el de tunelaje o fuerza atómica.

Una característica que resulta relevante dentro de la biotecnología es la biocompatiblidad de las nanopartículas, es decir qué tan benignas y funcionales son las interacciones entre ellas y su ambiente biológico. Si la interacción no genera respuestas tóxicas, inmunogénicas, trombogénicas o carcinogénicas, entonces el material es biocompatible.

La biocompatiblidad dependerá de las características físicas y químicas de los diferentes nanometeriales, así como del organismo con el que interactue. Por ejemplo, dependiendo del tamaño, las partículas pueden estimular cierto tipo de respuestas inmunitarias, pueden ser internalizadas en las células blanco o por fagocitos y/o pueden servir como adyuvantes. Por otro lado, es sabido que partículas con carga positiva suelen presentar mayor toxicidad que aquéllas neutras o cargadas negativamente. El tipo de carga puede afectar también su interacción con proteínas del plasma y su eliminación. Por otro lado, sus características hidrofóbicas también determinarán la naturaleza de sus interacciones inmunológicas, plasmáticas y la capacidad del organismo para eliminarlas. Finalmente, diferentes tipos de grupos funcionales en la superficie de las partículas influirá en las interacciones con las células u organelos blanco y evitará o inducirá una respuesta inmunitaria.

Existen cuatro diferentes formas de estudiar la biocompatibilidad del material y que tienen que ver con cómo interaccionan con el sistema inmunitario, con los componentes del plasma, si pueden ser eliminados del organismo y si cuentan con funcionalizaciones, en particular con polietilenglicol. Revisemos cada una de ellas.

La imnunocompatibilidad se encarga de medir la respuesta del sistema inmunitario a la exposición de materiales externos. Ya que las nanopartículas se encuentran en la escala de las células y proteínas inmunológicas, éstas pueden generar dos respuestas. Pueden activar o incrementar la respuesta inmune, conocido como inmunoestimulación. En este caso el organismo puede presentar síntomas de alergia e hipersensibilidad o inflamación, que pueden llegar a tener consecuencias graves en la salud. En contraste, las nanopartículas pueden tener el efecto contrario y suprimir o decrementar esta respuesta. En ocasiones como en transplantes o enfermedades auto inmunes, la inmunosupresión es deseada, sin embargo, también conlleva un aumento en la susceptibilidad a infecciones o cánceres.

También es probable que las nanopartículas interaccionen con componentes del plasma, provocando una serie de respuestas. Entre ellas, y que está relacionada con la inmunocompatibilidad, es la activación de macrófagos, leucocitos y células del complemento que puede desencadenar inmunoestimulación y eliminación de la partícula. Por otro lado, la presencia de nanomateriales en la sangre puede producir hemólisis, la agregación de plaquetas y puede modificar el tiempo de coagulación. Debido a que los efectos pueden resultar altamente dañinos, es importante conocer estas interacciones.

Finalmente, es importante saber si la partícula podrá ser eliminada exitosamente del organismo. Las nanopartículas con mayor probabilidad de biodegradación incluyen las de origen biológico como proteínas, algunos polisacáridos y algunos polímeros sintéticos. En este caso, la capacidad del organismo de eliminar al componente externo depende no sólo de las propiedades físicas y químicas de la partícula,  sino también del organismo y del sitio de implantación. Una exitosa eliminación es deseada para evitar efectos toxicológicos debido a un largo tiempo de exposición o acumulación de los nanomateriales en el organismo.

Para mejorar la biocompatiblidad, muchas nanopartículas son revestidas con polietilenglicol, un poliéster que ha demostrado tener múltiples ventajas, por ejemplo, retrasa la captura de nanopartículas por células del sistema inmune, lo que puede incrementar entonces la vida media de fármacos o que las partículas alcancen su destino final. Sin embargo, ya ha habido reportes del desarrollo de anticuerpos específicos contra este polímero por parte de los organismos, lo que puede generar su desecho o inmunoactivación.

La última característica de las nanopartículas que revisaremos es su toxicidad. Por sus diferentes características y tamaño, es posible que éstas intervengan con funciones celulares vitales. Por un lado, esta capacidad de interferencia puede ser usada como antibióticos o para combatir células cancerígenas y estudiar su biocompatiblidad. Sin embargo, es imprescindible conocer los efectos citotóxicos no deseados, así como su impacto ambiental. De hecho, el alto grado de toxicidad de los tubos de carbono ha retardado e imposiblitado de manera considerable el uso de esta estructura en la industria a pesar de su potencial.

La nanotoxicología es la disciplina encargada de estudiar las propiedades tóxicas de las nanopartículas y determinar en qué grado y si representan o no una amenaza biológica o ambiental. En el caso particular de las nanopartículas, sus efectos toxicológicos dependen, una vez más de sus características físicas y químicas. Pero también se verán afectadas por factores ambientales, como la temperatura, el pH, la fuerza iónica y la salinidad del medio, así como la vía de exposición y la dosis.

Hay dos vías principales por las cuales las nanopartículas generan un efecto tóxico. El primero de ellos es la formación de especies reactivas de oxígeno o ROS, que a su vez generan estrés oxidativo. Se ha demostrado que las nanopartículas de diferentes tamaños y naturaleza tienen una preferencia a movilizarse a la mitocondria, donde se encuentran organelos redox activos, cuyo funcionamiento puede verse alterado, produciendo una gran cantidad de ROS o interfiriendo con las defensas antioxidantes. El estrés oxidativo tiene como principales consecuencias la inflamación debido a daño mitocondrial, respuesta inmune exagerada, principalmente por la fagocitosis y activación de proteínas cinasas. También generan fibrosis por daño a membranas celulares y deposición de la matriz extracellular. Y finalmente, pueden causar cáncer debido a daño directo al ADN, por peroxidación de lípidos y/o formación de multinúcleos en las células.

La segunda vía de toxicidad es por daño directo al ADN o genotoxicidad. Este puede ser ser consecuencia de fragmentación cromosomal, ruptura de las cadenas de ADN, las nanopartículas pueden generar mutaciones  o producir aductos oxidativos de ADN. También pueden presentarse alteraciones en la expresión genética que a su vez generen mutagenesis y/o carcinogénesis.

Clasificación de los nanomateriales

Ahora veamos cómo se clasifican los nanomateriales. Existen cuatro categorías principales. La más obvia es el tamaño, que ya hemos mencionado va de 1 a 100 nm. También podemos clasificarlos de acuerdo a su forma. Las nanopartículas pueden ser sintetizadas en diferentes formas, que incluyen esferas, cubos, rodillos, algunas más complicadas como hélices o estrellas. Por otro lado, también podemos clasificarlas de acuerdo a las características de su superficie: es decir, si son o no solubles en agua, qué tipo de carga tienen, si contienen grupos funcionales o ligandos. Finalmente podemos clasificarlas de acuerdo al material del que están hechos. Esta clasificación es mucho más vasta, y va desde ADN, proteínas, polímeros y surfactantes, hasta metales y estructuras derivadas de carbono.

Caracterización de los nanomateriales

La siguiente pregunta es entonces qué herramientas o técnicas nos permiten identificar estas características de las nanopartículas. Obviamente la técnica a usar dependerá de las propiedades de las partículas pero también de las propiedades que queramos investigar. En la tabla se encuentran los métodos más empleados para caracterizar a los nanomateriales, sin embargo no son los únicos y actualmente la rama de la nanotecnología encaragada del desarrollo de técnicas más eficientes, menos costosas y con mayores resoluciones para caracterizar los materiales es de las más relevantes.

Por ejemplo la espectroscopia UV-Vis y la resonancia magnética nuclear nos brindan información sobre la composición química. Una de las técnicas más usadas en nanotecnología es la dispersión de luz dinámica, que nos da información acerca de las dimensiones de las partículas así como de su carga. Las técnicas de microscopía son altamente empleadas también. Entre las más populares encontramos la microcopia confocal de fluorescencia, muy usada en biología para la identificación de tejidos, moléculas y procesos celulares. Sin embargo, los caballitos de batalla para visualizar las nanopartículas son los microscopios electrónicos de transmisión y barrido, que permiten caracterizar el tamaño y morfología de los materiales. Nuevos desarrollos en estos microscopios también han permitido la caracterización y distribución de los materiales que componen las nanopartículas.

Finalmente, uno de los microscopios más empleados actualmente el de fuerza atómica que permite conocer el tamaño y morfología de las nanoestructuras, así como algunas propiedades físicas como resistencia y elasticidad o características químicas en la superficie de los nanomateriales.

Como se mencionó anteriormente, fueron los avances el terreno de la microcopía de alta resolución, quienes, entre otros, permitieron un verdadero desarrollo de la nanotecnología. La principal limitación de un microscopio esta dada por la resolución de Abbe y está descrita como la capacidad de un microscopio de distinguir dos elementos como distintos cuando se encuentran cerca. Dicha resolución depende inversamente del índice de refracción del medio y del ángulo de apertura. En cambio, depende directamente de de la longitud de onda promedio de la fuente de luz. Ahora, un microscopio convencional utiliza una fuente de iluminación que emite luz visible, es decir, la longitud de onda se encuentra entre 400-700 nm y que está fuera del rango de dimensiones de las nanopartículas. Sin embargo, si utilizamos fuentes de luz con longitudes de onda más pequeñas, como fluoróforos que emitan señal en el rango ultra violeta o si usamos electrones, logramos una reducción en la longitud de onda de cuatro órdenes de magnitud en un es decir, diez mil veces, lo que nos permite entonces visualizar estructuras en la nanoescala.

Empecemos entonces con el microscopio electrónico de barrido o SEM por sus siglas en inglés. El microscopio fue desarrollado por Mandred von Ardenne en 1937 y funciona como sigue: el microscopio consiste en una fuente de electrones, lentes electromagnéticos para controlar el flujo de electrones en alto vacío y un detector de electrones. Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz y está basado en la dualidad onda-partícula. El haz de electrones es producido por termoemisión, es acelerado y enfocado en la muestra usando lentes. Los electrones chocan con la muestra, que a su vez emite, entre otros, electrones secundarios que son detectados. El número de electrones secundarios depende de las variaciones de la superficie de la muestra. Al escanear el haz y detectar la variación del número de electrones emitidos, se puede reconstruir la topografía de la superficie de la muestra, así, las imágenes reproducidas se ven en 3D. Por otro lado, el haz de electrones también puede ionizar los átomos de la superficie de la muestra para que emitan rayos X, cuya energía depende del tipo de elemento que compone a la muestra. Al escanear una vez más y detectar los rayos X, se puede deducir la naturaleza química del material así como su variación espacial. Otro tipo de interacciones entre el haz de luz y la superficie de la muestra permite realizar diferentes análisis complementarios. El SEM permite obtener imágenes magnificadas de la superficie de muestras gruesas para analizar su forma, tamaño y composición. Se muestran dos ejemplos de imágenes que pueden obtenerse con el SEM, vemos detalles asombrosos del ojo de una mosca, así como espermatozoides rodeando un óvulo, donde las estructuras aparecen en tres dimensiones y con magnificaciones de hasta trescientos mil x. Para mejor control de los electrones, el SEM utiliza alto vacío y las muestras tienen que ser cubiertas con una capa delgada de metal para hacerlas conductivas, de modo que no puede analizar estructuras en solución o procesos celulares en tiempo real. Aunque los últimos avances en esta técnica han logrado observar estructuras en solución y sin cubierta con una técnica llamada microscopía electrónica de barrido ambiental.

Po otro lado, tenemos el microscopio electrónico de transmisión, desarrollado por primera vez por Max Knoll y Ernst Ruska en 1931, lo que le valió a Ruska el premio Nobel de física en 1986. El primer TEM comercial fue introducido en 1939 y funciona de la siguiente manera. Al igual que el SEM, utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz y está basado en la dualidad onda-partícula de los electrones. Consiste de igual forma, en una fuente emisora de electrones, lentes electromagnéticos y un detector de electrones. Sin embargo, en este caso, una muestra muy delgada se posiciona debajo del haz de electrones. El haz es producido por termoemisión, acelerado y enfocado por los lentes, para pasar a través de la muestra, quien modifica al haz e imprime su imagen. El haz es magnificado por otros lentes y detectado usando generalmente una pantalla fluorescente como un negativo (los electrones que interactuaron con la muestra no son transmitidos y aparecen como objetos negros en la pantalla). Este microscopio permite la magnificación de imágenes de muestras muy delgadas con resolución atómica. Existe un tipo de transmisión electrónica que combina el barrido y la transmisión, llamada microscopia de barrido y transmisión, donde el haz es enfocado en un punto específico de la muestra. El haz transmitido es detectado, mientras que un escaneo de la muestra permite visualizar una vez más la imagen magnificada de la muestra, lo que incrementa la resolución. Además, se pueden medir algunas de las características del haz transmitido en diferentes puntos de la muestra. Por ejemplo, puede medirse la pérdida de energía del electrón. Para ello, un prisma magnético es usado para desviar el haz de acuerdo a su energía. Entre más energía haya perdido el electrón, más desviado es. La medida de esta desviación permite caracterizar diferentes puntos de la muestra y permite visualizar e identificar la naturaleza química de diferentes partes de la muestra. Se muestran algunos ejemplos de imágenes producidas por este microscopio, tenemos a la izquierda una célula vegetal donde se identifican claramente los organelos, mientras en la derecha tenemos al virus del ébola, con una longitud de alrededor de una micra y con un diámetro de 80 nm, que podemos distinguir claramente. Al igual que el SEM, requiere alto vacío y en este caso las muestras deben ser muy delgadas, por lo que las células por ejemplo, deben ser cortadas muy finamente y cubiertas con metales pesados para incrementar el contraste. Esto limita el estudio una vez más de partículas en solución y su visualización en tiempo real. El TEM produce magnificaciones de hasta quinientos mil x.

El microscopio de fuerza atómica fue desarrollado por científicos del IBM en 1982, con el primero introducido comercialmente en 1986. El AFM es un microscopio de barrido que sondea la superficie de la muestra. Consiste en una punta posicionada al final de una pequeña viga y un sistema óptico que utiliza un láser para detectar las deflexiones de la punta. Cuando la punta entra en contacto con la muestra y es movida sobre su superficie, la desviación del láser permite medir el perfil de la muestra, así, el AFM permite visualizar la topografía de la superficie con resolución atómica. El modo más usado es el llamado de “tapping”, donde la viga y punta son ligeramente oscilados de arriba a abajo durante su desplazamiento. Es popular ya que produce menos daños a la muestra debido a menor contacto. Más aun, la detección de estas oscilaciones periódicas y su modificación a través de la superficie resulta en una resolución de la topografía más exacta. El AFM también puede medir la fuerza que actúa sobre la punta debido a las caracterísiticas de la superficie. Para ello, se mide la desviación de la punta mientras se acerca verticalmente a la superficie en una posición determinada. Entre más cerca se encuentre la muestra, es más atraída debido a fuerzas de atracción entre los átomos de la punta y la muestra, que se observa como una disminución en la altura en la gráfica. Sin embargo, cuando la punta y la muestra entran en contacto, la primera es repelida ya que los átomos no pueden penetrarse, y la fuerza se incrementa dramáticamente en la gráfica. La medida de este incremento puede ayudar a determinar diferentes características de la superficie como su elasticidad. Modificaciones en las características magnéticas o electrónicas de las puntas permiten medir las propiedades magnéticas o eléctricas de la superficie. En la imagen se muestra una punta de AFM funcionalizada con un tubo de carbono, que después es recubierto con oro. En este caso, el AFM permite la caracterización en solución de las partículas y en tiempo real, por ejemplo, en se muestra una imagen de AFM de cadenas de ADN. Ya que también es un microscopio de barrido, las imágenes aparecen en 3D. Con la habilidad de modificar las puntas con diferentes características y dimensiones se puede obtener información sobre la composición y propiedades químicas y físicas de las muestras. Más aún, se han logrado resoluciones a nivel atómico y molecular, como vemos en la imagen, que consiste en ensambles de 8-hidroxiquinolina. Sin embargo, uno de los problemas del AFM es que es una técnica más costosa, difícil y la obtención de imágenes de alta resolución es bastante lenta.

El último microscopio que revisaremos es el confocal de fluorescencia de alta resolución, conocido por sus siglas en inglés STED, que significa Stimulated Emisión Depletion, es decir, extinción de la emisión estimulada. El STED fue desarrollado recientemente por Stefan W. Hell y Jan Wichmann en 1994 y demostrado experimentalmente por el mismo Hell y Thomas Klar en 1999. Hell recibió el premio Nobel de Química en 2014 por su invención.

El STED funciona en principio como cualquier microscopio confocal de fluorescencia, donde se utiliza una fuente de luz cuya longitud de onda es seleccionada por espejos dicroicos para excitar al fluoroforo presente en la muestra que a su vez emitirá luz con una longitud de onda diferente que también es filtrada por los espejos dicroicos. Esta luz se conoce como Spot de excitación y está ilustrada en color verde en la imagen. Ahora, la innovación del STED consiste en capturar la longitud de onda emitida por el fluoróforo en la periferia de la imagen y excitarla una vez más, es decir, estimular su emisión. Al ser re-estimulados, su longitud de onda de emisión volverá a cambiar y quedará fuera del filtro de longitud de onda de emisión original, es decir, no será detectada. Este longitud de onda estimulada se conoce como Spot STED y se encuentra ilustrada en color rosa. Finalmente, ya que la periferia de emisión original fue eliminada, la emisión detectada produce el spot efectivo en color azul, que es detectado para formar la imagen. Como vemos este spot efectivo es de menor tamaño que el de excitación, lo que incrementa drásticamente la resolución, como vemos en esta imagen comparativa entre fibroblastos vistos por un microscopio de fluorescencia confocal convencional y el STED. Las ventajas del microscopio es que pueden observarse las nanoestructuras y nanomateriales en tiempo real y en solución. En teoría pueden alcanzarse resoluciones atómicas y es rápido. Sin embargo, las muestras requieren la presencia de un fluoroforo. Además, debido a la sobreexcitación de éste, el fluoroforo puede degradarse rápidamente, perdiendo su capacidad de fluorescencia.

Producción de  nanomateriales

Ya que sabemos cómo caracterizar los materiales, veamos cómo podemos producirlos. Existen una gran cantidad de técnicas para la fabricación de estructuras, sin embargo pueden clasificarse en dos: bottom-up (de abajo a arriba) o top-down (de arriba a abajo). La primera puede entenderse como una construcción, es decir, como la fabricación de materiales a partir de sus elementos estructurales. Esto tiene como ventaja la producción de estructuras con menos defectos, mayor homogeneidad y orden. En contraste, el top-down puede entenderse como la miniaturización, es decir, la fabricación de materiales en la nanoescala a partir de estructuras micro y macroscópicas. Las ventajas de estas técnicas es que suelen ser baratas, escalables y con buena uniformidad entre lotes. Ejemplos de cada una de ellas se encuentran listados en la diapositiva. Por ejemplo, en bottom-up tenemos la síntesis química, impresión en 3D y autoensamblaje de compuestos moleculares, ADN, proteínas, o compuestos inorgánicos como partículas metálicas o de poliestireno. Por otro lado, ejemplos de técnicas de top-down incluyen epitaxia de haz molecular, manipulación con microscopios y litografía, entre otros.

Ahondaremos brevemente en algunos ejemplos. Para obtener nanopartículas metálicas fluorescentes se requiere síntesis química. Primero es necesario obtener partículas de sílice fluorescentes a partir de la hidrólisis de precursores de sílice en presencia de un fluoróforo, en este caso, rodamina B. Una vez sintetizadas, es necesario recubrir dichas partículas con un precursor de sílice con grupos funcionales amino, para que la superficie de mis partículas tenga estos grupos. Por otro lado, es necesario sintetizar nanopartículas metálicas de óxido de hierro, que pueden obtenerse a partir de la oxidación de sales de hierro. Posteriormente, dichas nanopartículas metálicas deben ser funcionalizadas con grupos de bromo. Esto es para que, al mezclarlas con las partículas de sílice fluorescentes, se presente una reacción de sustitución nucleofílica entre los grupos bromo y amino que permita la deposición de las partículas metálicas en la superficie de las partículas de sílice por medio de enlaces covalentes, como se aprecia en la imagen de microscopio de transmisión. Finalmente son recubiertas con otra capa delgada de sílice para ayudar con la estabilización. Estas son imágenes de microscopía confocal de fluorescencia, donde se aprecian las partículas, aunque la resolución es un poco baja.

Por otro lado, la técnica de top-down más popular es la fotolitografía. este proceso involucra la transferencia de estructuras geométricas y patrones en una máscara sobre una superficie de silicon. Por medio de este proceso son fabricados los chips y otros componentes electrónicos. El proceso resumido está ilustrado en la figura y es como sigue. Primero el sustrato de sílice es recubierto con un fotoresistor, que al ser expuesto a un haz de luz reacciona para facilitar o dificultar su remoción en pasos posteriores. Para imprimir el diseño, se necesita una máscara que cuente con el patrón deseado, que se coloca entre un haz de luz y la oblea de sílice. Al exponer la máscara y la oblea a dicho haz, la máscara impide la interacción del haz con el resistor, y permite la modificación en la naturaleza química y física de las zonas expuestas. Después de este proceso se realizan diferentes tipos de revelado y lavado para remover fotoresistor que ha sido expuesto o no, dependiendo del fotoresistor usado, y dejar el diseño en el sustrato. Finalmente, las áreas impresas son dopadas para una adhesión más fuerte. De acuerdo a lo que se desee imprimir, el proceso puede repetirse varias veces y se pueden añadir diferentes materiales para hacer el material funcional.

Aplicaciones de la nanobiotecnología

En la última parte, hablaremos de las aplicaciones de la nanobiotecnología a grosso modo. Entre las principales aplicaciones de la nanobiotecnología encontramos las médicas, la ingeniería de tejidos, molecular, detección de patógenos, biosurfactantes y en seguridad alimentaria. Veamos cada una más a fondo.

Las aplicaciones de la tecnología en la medicina tienen como objetivo una mayor comprensión sobre distintas enfermedades y sus procesos, esto con el fin de identificar biomarcadores que permitan su temprana detección y diseñar fármacos que las combatan de manera más efectiva. Además la nanotecnología busca el desarrollo de materiales para que interactúen directamente con biomoléculas como bacterias, virus, toxinas, células, proteínas y ADN. Las áreas dentro de la medicina en las que la nanotecnología puede ser aplicada son el diagnóstico de enfermedades, la terapia génica y la entrega de fármacos.

En lo que se refiere a diagnóstico, la nanotecnología busca crear nuevos materiales y metodologías que permitan dignósticos tempranos, específicos y eficaces, que sean accesibles y realizados con equipo especializado. Entre los nanomateriales más populares para este fin encontramos las nanopartículas metálicas, como el oro o la plata, ARN, los quantum dos, que revisamos anteriormente y que pueden ser fuincionalizadas para lograr afinidad con biomoléculas. Un último ejemplo son los nanocuerpos que son altamente específicos, seguros, estables e inocuos. Entre ellos están los áptamero, como vemos en la imagen. En este caso específco, el aptámero consta de una cadena de ADN con afinidad con ATP y con una molécula reportero, que puede ser un fluoróforo. Este complejo tiene afinidad por partículas de oro para facilitar su entrega. Al encontrarse con ATP, el aptámero se une a él, liberando a la molécula reportero. Este sistema puede ser utilizado para diagnóstico y medición de analitos en función de la intensidad de fluorescencia emitida.

Por otro lado, tenemos la terapia génica, en la que obviamente la nanotecnología tiene ingerencia para tratar de prevenir y tratar enfermedades de origen genético. La terapia trata de corregir o reemplazar los genes dañados para corregir y curar los padecimientos. Ventajas del uso de nanomateriales para este fin incluyen la protección del material genético, especificidad con la que se espera reducir los efectos secundarios, facilitar la entrada y entrega del material genético e incrementar su estabilidad. La idea detrás de la terapia génica está resumida en la imagen, donde el primer paso es obtener las células dañadas del paciente. In vitro, se hace entrega del gen terapéutico a través de un nanovehículo, que suelen ser pseudovirus por obvias razones. El gen es reparado o sustituido y las células empiezan a expresar las proteínas deseadas. Finalmente, las células son inyectadas al paciente para su tratamiento.

También la nanotecnología está implicada en la entrega de fármacos para mejorar su eficacia y especificidad. La idea es entregar el fármaco en el lugar, dosis y tiempo requerido y con eso reducir también efectos secundarios y/o tóxicos. Las ventajas de usar nanopartículas en este terreno incluyen la co-entrega de fármacos no compatibles, poder tener en la misma molécula el marcador y fármaco, conocido como teranóstico, y facilitar o evitar el cruce de la barrera encefálica y/o umbilical.

El estudio  realizado por Zhang y colaboradores, es un muy buen ejemplo del uso de diferentes nanomoléculas para crear una estructura que permita la entrega de fármacos al núcleo celular y que resume muy bien algunas de los temas que hemos hablado. La molécula consta de de quantum dots en el centro para marcaje y seguimiento de la partícula. Éstos están recubiertos por una capa de sílice porosa, donde encontramos un complejo de ADN híbrido con doxorubicina y una secuencia complemento de antimiR-21. El primero es un fármaco usado en quimioterapia y el miR-21 un ARN microsomal sobreexpresado en células cancerosas. Finalmente en la superficie de la partícula encontramos PEG y ADN de anclaje. En este caso, el ADN de anclaje consta de un aptámero rico en guanina para su unión específica con células cancerígenas para mayor especificidad y  para aumentar su eficacia. PEG por otro lado, sirve para evitar que células no cancerígenas internalicen a la molécula para disminuir efectos o toxicidad secundaria. Una vez dentro de la célula blanco, la el miR-21 sobreexpresado es usado como llave para “abrir” el híbrido de ADN, al unirse con la secuencia complemento, liberando la doxorubicina.

Otra aplicación de la nanobiotecnología es en la ingeniería de tejidos. En este caso, se utilizan los principios de transplante celular e ingeniería para construir sustitutos biológicos de tejidos y/o órganos. En particular, la nanotecnología se enfoca en la creación de biomateriales que dirijan las interacciones entre las células y su microambiente y del diseño de biomateriales que sirvan como andamio para el tejido a generar.

Por otro lado, las nanopartículas son altamente utilizadas para identificar y eliminar patógenos, ya que han mostrado mejorar la eficacia, rapidez y especificidad al ser capaces de identificar exitosamente determinados patógenos con alta sensiblidad. Esto se ha logrado a partir de la funcionalización de las nanopartículas para la unión específica a ciertas biomoléculas características de las células patógenas. Como ya hemos revisado, el tamaño permite la interacción directa con células y organismos indeseados. Quizá el ejemplo más popular son las nanopartíclas de plata. Como vemos en el esquema de la derecha, Zhou et al. diseñaron una estrategia basada en espectroscopia Raman para detectar bacterias en agua potable, usando partículas de plata que se depositan en la membrana celular por interacciones electrostáticas y son posteriormente reducidas y detectadas con alta sensibilidad.

Sin embargo, como pueden ver en la tabla, existen una numerosa cantidad de partículas con diferentes propiedades y tamaños que son capaces de detectar a una diversa cantidad de bacterias importantes y comunes generadoras de padecimientos. En la tabla se señalan también sus ventajas y las cantidades tan pequeñas que son capaces de detectar.

En un tema relacionado, la nanotecnología también es empleada dentro de la seguridad alimentaria a través de la adición de antioxidantes, agentes microbianos y biosensores para determinar con alta sensibilidad y especificidad ciertos compuestos de interés, especialmente alergenos o tóxicos. En este caso, los anticuerpos y enzimas son particularmente usadas. En este ejemplo, Cadkova y colaboradores combinaron un inmunosensor electroquímico contra ovoalbúmina que es un alergeno muy común. En él, un inmunocomplejo tipo sándwich se forma entre la partícula magnética funcionalizada con un anticuerpo anti-ovoalbúmina, para lograr aislar la molécula. Después, un anticuerpo secundario anti-ovoalbúmina conjugado con peroxidasa de rábano es añadido como molécula reportero. Finalmente, la señal electroquímica producida por la reducción de peróxido de hidrógeno por reacción enzimática de la peoxidasa, es medida. En este caso utilizaron la tionina para amplificar la señal. El método resultó bastante sensible y logró la cuantificación de 11 a 222 nM de ovoalbúmina.  En esta tabla se resumen muchos más métodos para detectar otros alergenos, la mayoría basados en anticuerpos y con límites de detección francamente impresionantes.

Finalmente, la nanobiotecnología tiene aplicaciones importantes en la industria como los biosurfactantes, que son sustancias activas que reducen la tensión superficial y que son altamente utilizados en una gran variedad de industrias que incluyen la alimentaria, cosmética, farmacéutica, agrícola, entre otras. En particular los biosurfactantes son de interés por su capacidad de biodegradación y biocompatibilidad y capacidad de autoensamblaje, como vemos en el ejemplo, que con simples cambios de pH tenemos diferentes estructuras.

Y para concluir, la biomimética es una de las ramas donde la nanobiotecnología es especialmente útil. Esta rama toma a la naturaleza como inspiración para adaptar y producir nanomateriales o nanoprocesos. Como ejemplo, tenemos a las bacterias, cuyos flagelos son son de interés y fundamentales para la movilidad de nanorobots. Por otro lado, los virus son estructuras proteicas que se autoensamblan para proteger, transportar en introducir eficientemente ADN o ARN a células huésped. Son por ello el sistema ideal para estudiar el auto ensamblaje y para ser usados como vectores de material genético o fármacos.

En algunos insectos se ha encontrado que su coloración proviene no de pigmentos sino de la interacción entre su estructura micro y nanométrica y la luz. Estas estructuras pueden servir como inspiración para el diseño de materiales.

Y por último, las plantas son por excelencia el mejor ejemplo de eficiente conversión química de energía, por lo que sus procesos de transformación pueden ser imitados y adaptados con fines industriales.

Las referencias utilizadas en este trabajo, se encuentran en la presentación adjunta.