Tinción de Cristal Violeta (0.5%) en cultivo de células adherentes

Descripción

Durante la muerte celular las células adherentes en cultivo se desprenden del fondo de la placa de cultivo. Esta característica se puede usar para la cuantificación indirecta de la muerte celular y para determinar las diferencias en la proliferación tras la estimulación con agentes que inducen la muerte. Un método simple para detectar la adherencia mantenida de las células es la tinción con colorante cristal violeta, el cual interactúa con las proteínas y el ADN. Por lo tanto, las células que sufren muerte celular pierden su adherencia y posteriormente en proceso de tinción se pierden está población de células, reduciendo la cantidad de tinción que será cuantificado. Este protocolo describe un método de detección rápido y confiable que es adecuado para el examen del impacto de los agentes quimioterapéuticos u otros compuestos sobre la supervivencia celular y la inhibición del crecimiento. La tinción con violeta cristal es un ensayo rápido para evaluar la viabilidad celular bajo diversas condiciones de estimulación (Geserick et al., 2009). Sin embargo, está potencialmente comprometido por las respuestas proliferativas que ocurren al mismo tiempo que las respuestas de muerte celular. Alternativamente, se pueden realizar estudios moleculares para abordar más específicamente la naturaleza de la muerte celular (Feoktistova et al., 2011).

Materiales

• Cajas de cultivo de 25-75 cm²
• Cajas de 96 pozos
• Pipetas de 1000, 200, 20, 10, 3 µL
• Pipetas multicanales de 8 o 12 canales (200, 20, 10 µL)
• Puntas de 1000, 200 y 20 µL
• Guantes de nitrilo o látex
• Papel filtro whatman
• Lector de placas  de 96 pozos (absorbancia a 570 nm)

Reactivos

• Línea celular adherente de su interés 
• Medio de cultivo: Use el medio apropiado de acuerdo al tipo celular
• Disolución de cristal violeta (0.5%) 
• Tratamientos apropiados para los objetivos del experimento (ej.: cisplatino, 5-FU, etc.)
• Metanol

Procedimiento

1. Disuelva el polvo del cristal violeta en el agua (tabla 1) y después agregue el metanol. Este procedimiento no requiere de esterilización. NOTA: Almacene la disolución en oscuridad y a temperatura ambiente. Úselo por 2-3 meses 
2. Cultive las células en las cajas de 96 pozos. Tres pozos no deben contener ni células ni medio. Asegúrese de que el volumen del medio de cultivo sea ≥100 µL/pozo para evitar efectos de evaporación. Incube las células durante 24 h a 37˚C para promover la adhesión de las células a los pozos.
3. Usualmente se deben sembrar de 2-3 × 10⁴ células/pozo o llevar a una confluencia entre ∼40–50%. La confluencia inicial dependerá de la proliferación celular y el tamaño de la célula que habrá de usarse (ajuste sus condiciones de acuerdo a la línea).  Los pozos vacíos servirán como controles de unión inespecífica del colorante con el pozo. 
4. Posterior a las 24 h retire el medio de los pozos y adicione ≥100 µL/pozo de medio fresco suplementado con el tratamiento apropiado para sus objetivos. NOTA: No deje que las células se queden sin medio y se sequen, las células que se han secado podrían no inducir la muerte celular. 
5. Trate las células al menos por triplicado de cada condición. No aplique tratamiento a 3 pozos con células estas servirán como controles. Incube las células en el tiempo deseado en las condiciones deseadas. Diferentes concentraciones de tratamientos deberán ser analizados en experimentos preliminares para determinar la dosis de la inducción de la muerte celular. 
6. Posterior al tratamiento, retire el medio y lave gentilmente las células con PBS 1X y agregue glutaraldehido al 1% hasta llenar pozo (50-100 µL) para fijar las células e incube 10-20 min.
7. Lave muy gentilmente con agua corriente del grifo inclinando el plato para evitar que el agua golpee directamente las células en monocapa y se desprendan.
8. Después del lavado elimine el agua de los pozos e invierta la placa y coloque la placa sobre papel absorbente o papel filtro para remover el líquido remanente. NOTA: Si las células que está analizando se adhieren débilmente al plato tenga mucha más precaución en este procedimiento. 
9. Después del secado agregue 50 µL de cristal violeta al 0.5% a cada pozo e incube por 20 min a temperatura ambiente o en una placa de agitación con una frecuencia de 20 oscilaciones por minuto. 
10. Lave el plato 4 veces en agua corriente del grifo y después invierta el plato en papel filtro.
11. Seque al aire su placa sin la tapa por lo menos 2 horas a temperatura ambiente. Es recomendable secar la placa por lo menos 24 horas.
12. Agregue 200 µL de metanol en cada pozo e incube la placa por 20 min a temperatura ambiente sobre una  placa de agitación con una frecuencia de 20 oscilaciones por minuto. 
13. Después, mida la densidad óptica  de cada pozo a 570 nm (OD₅₇₀) en un lector de placas. 
14. Reste el promedio de la OD₅₇₀ de cada pozo sin células del OD₅₇₀ de cada pozo con células tratadas. NOTA: aquí se resta el ruido de fondo de la tinción del pozo 
15. El conjunto promedio de OD₅₇₀ de las células no estimuladas serán el 100%. Luego, determine el porcentaje de células estimuladas con los valores promedio de OD₅₇₀ y los valores promedios de las no estimuladas.
16. Calcule el promedio y el error estándar para al menos 3 experimentos independientes. 

Tabla 1. Cristal Violeta (0.5%)

Disolución para la tinción con Cristal Violeta (0.5%)
Cristal violeta	0.25g
Agua destilada	40 mL
metanol	10 mL