Método: Extracción de ADN plasmídico (Lisis alcalina modificado)

total de vistas
Visitas
Imprimir
Nivel avanzado
Autor

Coautor(es)


Introducción

Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosomal capaces de replicar independientemente del cromosoma. La mayoría de los plásmidos son circulares, pero, recientemente se han identificado plásmidos lineales. Los plásmidos generalmente se encuentra distribuidos en bacterias, aunque también suelen encontrarse en algunas hongos y levaduras. En general no son esenciales, sin embargo en algunos casos proveen a las células ventajas selectivas.

Los plásmidos han sido usados como herramientas en diferentes áreas de la biología como: la biotecnología y la biología molecular usandolos para la clonación del ADN. Esto es gracias a su pequeño tamaño en comparación con los cromosomas que facilita su extracción y su manipulación. Además, sus propiedades de replicación y conjugación son de gran ayuda para el análisis genético. Existen diferentes técnicas para aislar el ADN plasmídico y uno de los métodos más usado es el método de extracción por lisis alcalina. Este método aprovecha las diferencias en el tamaño y la superhelicidad que es el grado de torsión que sufre el ADN plasmídico en contraste con el cromosomal. La mayoría de los cromosomas bacterianos, son moléculas circulares extremadamente grandes que no se encuentran superenrollados, mientras que los plásmidos son moléculas pequeñas y superenrolladas. Durante el proceso de extracción, se busca desnaturalizar el ADN plasmídico y el cromosomal y posteriormente renaturalizarlo, con el fin de que el ADN cromosomal, no se aparee rápidamente y pueda ser atrapado por complejos proteicos, los cuales precipitaran; a diferencia del ADN plasmídico que rápidamente se renaturalizan y adquirirá su conformación natural.

Usando el método de extracción por lisis alcalina se puede obtener entre 100-500 µg de ADN partiendo de 1.5 mL de cultivo de bacterias en fase exponencial con un moderado número de copias (10 a 20 por bacteria). Pero la pureza y cantidad del ADN dependerá de los siguientes factores:

  1. Mayor tamaño del plásmido, menor cantidad y pureza de ADN.
  2. Mayor número de copias del plásmido, mayor cantidad de ADN.
  3. Cepas que producen grandes cantidades de carbohidratos deterioran la pureza del ADN e interfieren con la actividad de las enzimas de restricción.

Material

  1. Micropipetas
  2. tubos de ensayo
  3. tapones para tubos de cultivo
  4. tubos de 1.5 mL
  5. centrifuga refrigerada para tubos 1.5 mL
  6. botellas para colocar los buffers o reactivos
  7. recipiente para colocar hielo
  8. Vortex
  9. Centrífuga con vacío para secar muestras

Reactivos

  1. Medio de cultivo
  2. Agua ultra pura libre de nucleasas
  3. RNAsa
  4. Tris base
  5. EDTA
  6. Hidróxido de sodio NaOH
  7. SDS
  8. Acetato de sodio C2H3NaO2
  9. Hielo
  10. Etanol grado biología molecular
  11. Agarosa

Procedimiento

El siguiente método es una modificación donde se omite el uso de disolventes orgánicos como: fenol y cloroformo. 

 

  1. Inocular 3 mL de medio de cultivo e incubar 12 horas a la temperatura óptima de la cepa y en agitación.
  2. Transferir 1.5 mL del cultivo a un tubo nuevo estéril y libre de nucleasas y centrifugar a 13,000 x g por 1 minuto.
  3. Desechar el sobrenadante y lavar el botón con agua estéril y libre de nucleasas para retirar totalmente el medio de cultivo. NOTA: El medio de cultivo interfiere con la pureza del ADN.
  4. Resuspender el botón celular en 100 µL de RNAsa/TE en un vortex. TE: 10 mM Tris ph 7.5 y EDTA 1 mM, RNAsa 5 mg/mL. NOTA: La glucosa es más común en cósmidos. Esta disolución isotónica secuestra los iones presentes en el medio, que son cofactores de las endonucleasas.
  5. Adicionar 450 µL de NaOH 100 mM/SDS 0.5% y agitar por inversión. NOTA: El SDS es un detergente que rompe las membranas bacterianas y desnaturaliza proteínas. El NaOH desnaturaliza el ADN.
  6. Adicionar 225 µL de Acetato de sodio 3 M, pH 5.2 y agitar por inversión. NOTA: El acetato renaturaliza las cadenas de ADN, puede ser de potasio 5M. Además, el potasio forma complejos con el SDS que a su vez interaccionan con las proteínas formando precipitados junto con el ADN cromosomal.
  7. Deja incubando 10 min sobre hielo. NOTA: es necesario dejarlo inmediatamente sobre hielo para mejorar la extracción
  8. Centrifugar a 14,000 x g a 4°C durante 10 min. NOTA: los complejos ADN cromosomal-proteínas precipitan, y el ADN plasmídico permanece disuelto.
  9. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5 mL.  NOTA: la concentración de ADN no es suficiente para saturar la disolución.
  10. Adicionar al sobrenadante 700 µL de etanol frío al 99.9 % y dar vortex. NOTA: El ADN es insoluble en etanol, por lo que precipita.
  11. Centrifugar a 14,000 x g a 4 °C durante 5 min. NOTA: esto ayudará a precipitar el ADN y formará un botón traslúcido.
  12. Retirar el sobrenadante y adicionar 1 mL de etanol al 70 %. NOTA: el acetato y otras sales presentes se disuelven en agua contenida en el etanol. 
  13. Resuspender con ayuda con un vortex y centrifugar a temperatura ambiente a máxima velocidad durante 2 min. NOTA: Para pureza de la extracción repita los pasos 12 y 13
  14. Retirar el sobrenadante y seque la muestra con una centrífuga con vacío (speed vac).
  15. Resuspender en 50-100µL de agua ultra pura libre de nucleasas o TE
  16. Analizar 2 µL de muestra en un gel de agarosa al 1 %.

Resultado

Figura 1. Imagen en negativo de un gel de agarosa 1%. Dos extracciones del plásmido pBBR1MCS5 donde se puede apreciar dos bandas. La banda de mayor peso molecular representa concatámeros (2 o más plásmidos unidos derivados del proceso de replicación). Este tipo de moléculas se cortan posteriormente con una topoisomerasa para separar los plásmidos involucrados y la banda de menor peso molecular corresponde a los plásmidos individuales. Foto de: Orlando Santillán

Mapa del plásmido: usando SanpGene

Referencias:

Birnbom, H. C. 1983. A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA. Meth. Enzymol. 100: 243-255. Birnbom, H. C. and Doly, J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nuc. Acids. Res. 7: 1513-1523. Yamamoto, T. and Horikoshi, M. 1995. Rapid preparation of plasmid templates suitables for a DNA sequencer without RNAse treatment. Nuc. Acids Res. 25: 3351-3352.

Deja un comentario

Sé el primero en comentar!

Debes registrarte para poder comentar.

wpDiscuz